Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://kodomo.cmm.msu.ru/~Redwitch/t5_files/Glotova_Lyubetsky.doc Дата изменения: Wed Dec 20 09:07:49 2006 Дата индексирования: Tue Oct 2 15:12:13 2012 Кодировка: koi8-r

Молекулярная динамика лизоцима
организма Leptonychotes weddelli

Авторы: Глотова Ирина,
Любецкая Анна
Аннотация

В данной работе изучен лизоцим организма Leptonychotes weddelli
(LYSC_LEPWE). Была проведена молекулярная динамика белка в свободном
состоянии в течение 128 пс и комплексе с лигандом (сахаром - 3-N-
ацетилглюкозамином) в течение 132 пс. Анализ структур на первом и последнем
шагах динамики не выявляет серьезных ошибок и дает вполне ожидаемые
закономерности. На начальной стадии взаимодействия белка с лигандом
наблюдается некоторое разрыхление его структуры.

Введение

Лизоцим или же мурамидаза является ферментом класса гидролаз,
катализирующий гидролиз (-(1->4)-гликозидной связи между остатками N-
ацетилглюкозамина и N-ацетилмураминовой кислоты пептидогликана клеточной
стенки бактерий. Лизоцим обнаружен практически во всех организмах. У
позвоночных содержится в основном в слезах, слюне, селезенке, легких,
почках и лейкоцитах; в тканях локализуется в лизосомах.
Лизоцим является мономером, в структуре которого выделяют два домена.
Между ними находится полость, в которой происходит сорбция и гидролиз
субстрата (см. рис.1). Главную роль в механизме гидролиза гликозидной связи
играют группа СОО- остатка Asp52 (поляризует связь) и недиссоциированный
карбоксил остатка Glu35 (донор протона) [1, 2].
В работе был изучен лизоцим, характерный для тюленя Уэдделла
(Leptonychotes weddelli), в свободном состоянии и в состоянии, связанном с
лигандом (сахар 3-N-ацетилглюкозамин).
[pic]
Рис.1. Структура лизоцима радужной форели, используемая в
работе в роли модели. На рисунке выделены ? -домен и ?-домен
белка и полость, расположенная между ними (Cleft) [1,2].

Материалы и методы

. Информация о ферменте получена из базы данных Swiss-Prot.
. Выравнивание белка с белком-моделью (PDB: 1lmp, лизоцим радужной
форели) было построено с помощью сервиса Clustal и программы GeneDoc.
. Для запуска молекулярной динамики были подготовлены два набора файлов:
структура белка в связанном с лигандом и свободном состояниях. PDB
файлы были получены программой MODELLER.
. Качество моделей было оценено в соответствии с информацией сервиса
WhatCheck.
. Для проведения молекулярной динамики и анализа данных использовались
программы пакета GROMACS.
. Графики и рисунки, предоставленные в работе, были получены с помощью
программ Excel, SwissPdbViewer и PyMol.
. Файл с движениями белка в свободном состоянии и в комплексе с лигандом
был получен с помощью программы PyMol.
Система, которая была использована в симуляции молекулярной динамики
лизоцима состояла:
o в случае белка в свободном состоянии: из 1344 атомов белка, 6 атомов
Cl-, 17823 атомов воды, всего 19173 атомов.
o в случае комплекса белка с лигандом: из 1344 атомов белка, 6 атомов Cl-
, 56 атома олигосахарида, 17763 атома воды, всего 19169 атомов.
Электростатические взаимодействия в течение молекулярной динамики были
посчитаны с использованием метода двойного обрезания (Cut-off). Для
ограничения длин всех связей был использован алгоритм LINCS.

Результаты

Отметим, что динамика по независящим от авторов работы причинам была
оборвана на ранних шагах (динамика лизоцима в свободном состоянии длилась
128 пс, а лизоцима с лигандом - 132 пс). В соответствии с этим в дальнейшем
необходимо делать поправку на время.
1) Движения белка
Движения белка в комплексе и в свободном состоянии в течение динамики
можно посмотреть в файле free_complex.pse.

2) Траектория изменения среднеквадратичного отклонения структуры от
времени.
[pic]
Рис.2

Видно, что можно провести на графике горизонтальную асимптоту, а значит
значения RMSD с незначительными отклонениями со временем выйдут на плато.
Это свидетельствет о том, что структура стабилизируется в процессе
динамики, и можно ожидать положительный результат в случае проведения более
длительной динамики.

3) Траектория флуктуаций отклонения атомов.
[pic]
Рис.3

Флуктуации отклонения атомов в среднем не превышают 0,3 ангстрема, а те
немногие пики, что встречаются, относятся к подвижности водородов при азоте
в боковых радикалах аргинина и гистидина, что не противоречит
биологическому смыслу, потому что эти атомы являются достаточно подвижными.
Амплитуда движений атомов белка в комплексе с лигандом мало чем отличается
от амплитуды движений атомов белка в свободном состоянии. Поэтому можно
сделать вывод, что прочное связывание лизоцима с сахаром на последнем шаге
динамики комплекса (132 пс) не наблюдается.

4) Изменение количества водородных связей со временем между белком и
лигандом.
[pic]
Рис.4

Видно, что в течение симуляции количество водородных связей между
белком и лигандом изменяется от 1 до 6. На первом шаге найдены 2 водородные
связи. На последнем шаге симуляции точно установлено наличие лишь 1
водородной связи (см. рис.5), в то время как по белку-модели предполагалось
наличие трех. Этот результат подтверждает то, что прочное связывание
лизоцима с лигандом на последнем шаге динамики комплекса не наблюдается.

[pic]
Рис.5. Зона контакта лизоцима с лигандом на последнем шаге симуляции.
Единственная водородная связь образуется между атомом кислорода Ala108
и атомом азота 3-N-ацетилглюкозамина.

5) Изменение поверхности белка и комплекса.

[pic]
Рис.6
[pic]
Рис.7

Видно, что как гидрофобная, так и гидрофильная поверхность в случае
связанного с лигандом белка больше, чем в случае несвязанного. Это может
быть связано с тем, что лизоцим разрыхляется для образования комплекса с
сахаром.

6) Изменение потенциальной энергии и температуры систем.

|Белок в комплексе |Несвязанный белок |
|Изменения энергии на последнем шаге по сравнению с первым |
|Потенциальная |Температура |Потенциальная |Температура |
|эн. | |эн. | |
|-5845 |5,6 |-4646 |3,7 |

Табл.1

Потенциальная энергия в обеих системах понизилась на последнем шаге по
сравнению с первым, что согласуется с ожидаемым результатом, поскольку в
процессе динамики должна происходить стабилизация структур. Температура
системы в обоих случаях незначительно повысилась.

7) Изменение карты элементов вторичной структуры белка и комплекса со
временем
Большая часть элементов вторичной структуры лизоцима, как в комплексе с
лигандом, так и в свободном состоянии, сохраняется в процессе молекулярной
динамики. Значительные изменения наблюдаются в областях поворотов и в
петлях, что можно объяснить их подвижностью. Бета-листы и альфа-спирали,
как более жесткие структуры, остаются достаточно консервативными в
процессе динамики (см. Glotova_Lyubetsky.xls, лист SSE, sec_str_free.gif,
sec_str_complex.gif).

8) Карта Рамачандрана для белка и комплекса

[pic][pic]

Рис.8. Карта Рамачандрана белка LYSC_LEPWE Рис.9. Карта
Рамачандрана белка LYSC_LEPWE
в свободном состоянии на первом шаге МД. в свободном состоянии
на последнем шаге МД.

Примечание: В полученном PDB файле белка в свободном состоянии
отсутствовала модель, соответствующая последнему шагу МД, поэтому карта
была построена в Excel (рис.9).
[pic][pic]

Рис.10. Карта Рамачандрана белка LYSC_LEPWE, Рис.11. Карта
Рамачандрана белка LYSC_LEPWE, связанного с лигандом, на последнем
шаге МД. связанного с лигандом, на первом шаге МД.

На карте Рамачандрана белка в свободном состоянии на первом шаге
динамики есть 14 аминокислотных остатков, находящихся в недопустимой
области значений углов ? и ?. На последнем же шаге динамики таких остатков
9. Аналогично для комплекса белка с лигандом на первом шаге остатков 7, а
на последнем шаге остатков 14 (см. Glotova_Lyubetsky.xls, листы Ramach_nb и
Ramach_b). Таким образом, на последнем шаге динамики лизоцима в свободном
состоянии качество модели улучшается, а в случае комплекса лизоцима с
лигандом ухудшается.
В целом остатки, находящиеся в недопустимых областях карты
Рамачандрана, могут свидетельствовать о не очень хорошем качестве
полученной модели. Но также они могут указывать на то, что связывание белка
с лигандом происходит специфичным образом и требует маргинальных значений
торсионных углов некоторых остатков.


Обсуждение

Поскольку в данной работе молекулярная динамика протекала в течение
достаточно короткого времени, то трудно делать выводы о том, какие
конформации происходят в структуре белка в процессе связывания 3-N-
ацетилглюкозамина. В соответствии с наблюдениями движений лизоцима в
свободном состоянии и в комплексе с лигандом и полученными результатами
можно сказать, что на начальной стадии взаимодействия белка с лигандом
наблюдается некоторое разрыхление его структуры. Прочное связывание лиганда
лизоцимом на данном этапе не обнаружено.
Анализ моделей на первом и последнем шагах динамики не выявляет
серьезных ошибок и дает вполне ожидаемые закономерности. Поэтому можно
предположить, что использованные для динамики структуры являются достаточно
качественными и более продолжительная динамика этих структур должна дать
положительные результаты.


Литература

1. Энциклопедия Wikipedia (http://en.wikipedia.org/wiki/Lysozyme).
2. H. Van Dael (1998), Chimeras of human lysozyme and ?-lactalbumin: an
interesting tool of studying partially folded states during protein
folding. CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 54


Приложение

Все данные, полученные в результате динамики лизоцима в свободном
состоянии и в комплексе с лигандом, лежат в файле Glotova_Lyubetsky.xls.