Занятие 5 (зачетное). Что кодирует фрагмент нуклеотидной последовательности?

Дано: неаннотированный фрагмент генома бактерии Yersinia intermedia (AC EMBL: AALF01000001; координаты последовательности в записи [126001..133000]). Дан также протеом бактерии-прототипа Escherichia coli K-12 .

Задача: определить, кодирует ли заданный фрагмент что-либо, похожее на какой-либо белок из прототипного организма.

Вариант 2

Был получен заданный фрагмент генома Yersinia intermedia длины 7000 нуклеотидов с помощью программы seqret. Чтобы определить, есть ли в этом фрагменте гены, похожие на гены бактерии-прототипа Escherichia coli K-12, было проведены следующие операции:

1. Полный протеом E.coli был получен из SwissProt. Были созданы индексные файлы для поиска программами пакета BLAST.

   
   formatdb -i ecoli -p T -n ecoli
   
   

2. Затем из данного фрагмента были извлечены трансляции всех открытых рамок считывания длиной не менее 240 нуклеотидов. При этом была использована программа getorf пакета EMBOSS.

   
   getorf -minsize 240 -table 11 -find 1 
   
   

   Используется стандартный для бактерий (bacterial) генетический код, открытой рамкой считается последовательность, начинающуюся со старт-кодона и заканчивающуюся стоп-кодоном.
3. Чтобы найти всех гомологов в протеоме E.coli была использована программа blastp, т.к. после поиска и транслирования всех ORF задача свелась к поиску сходных аминокислотных последовательностей при условии E-value<0,001.

   
   blastall -p blastp -d ecoli -i bac -e 0.001 -o homologs 
   
   

4. Затем с использованием возможностей Excel был написан скрипт для подсчета числа сходных последовательностей для каждой ORF из заданного фрагмента генома Yersinia intermedia.

   
   seqret bac:AALF01000001_1 stdout | blastall -p blastp -d ecoli -e 0.001 | grep -c ">" >> kolvo;
   seqret bac:AALF01000001_2 stdout | blastall -p blastp -d ecoli -e 0.001 | grep -c ">" >> kolvo;
   seqret bac:AALF01000001_3 stdout | blastall -p blastp -d ecoli -e 0.001 | grep -c ">" >> kolvo;
   seqret bac:AALF01000001_4 stdout | blastall -p blastp -d ecoli -e 0.001 | grep -c ">" >> kolvo;
   seqret bac:AALF01000001_5 stdout | blastall -p blastp -d ecoli -e 0.001 | grep -c ">" >> kolvo;
   seqret bac:AALF01000001_6 stdout | blastall -p blastp -d ecoli -e 0.001 | grep -c ">" >> kolvo;
   seqret bac:AALF01000001_7 stdout | blastall -p blastp -d ecoli -e 0.001 | grep -c ">" >> kolvo;
   seqret bac:AALF01000001_8 stdout | blastall -p blastp -d ecoli -e 0.001 | grep -c ">" >> kolvo;
   seqret bac:AALF01000001_9 stdout | blastall -p blastp -d ecoli -e 0.001 | grep -c ">" >> kolvo;
   seqret bac:AALF01000001_10 stdout | blastall -p blastp -d ecoli -e 0.001 | grep -c ">" >> kolvo;
   seqret bac:AALF01000001_11 stdout | blastall -p blastp -d ecoli -e 0.001 | grep -c ">" >> kolvo;
   seqret bac:AALF01000001_12 stdout | blastall -p blastp -d ecoli -e 0.001 | grep -c ">" >> kolvo;
   seqret bac:AALF01000001_13 stdout | blastall -p blastp -d ecoli -e 0.001 | grep -c ">" >> kolvo;
   seqret bac:AALF01000001_14 stdout | blastall -p blastp -d ecoli -e 0.001 | grep -c ">" >> kolvo;
   seqret bac:AALF01000001_15 stdout | blastall -p blastp -d ecoli -e 0.001 | grep -c ">" >> kolvo;
   seqret bac:AALF01000001_16 stdout | blastall -p blastp -d ecoli -e 0.001 | grep -c ">" >> kolvo;
   
   

   где bac - файл, содержащий аминокислотные последовательности найденных ORF, AALF01000001_N - их идентификаторы, kolvo - файл, содержащий столбец чисел, каждое из которых равно количеству сходных последовательностей из E.coli для соответствующей ORF.
5. Была создана книга Excel, включающая информацию обо всех открытых рамках считывания в данном фрагменте генома и число сходных последовательностей, найденных у E. coli при условии E-value<0,001.

Полученные результаты.

• Описание взаимного расположения предполагаемых генов (т.е., открытых рамок, для которых нашелся сходный участок протеома E. coli) в заданном фрагменте.

  Гипотетические гены во фрагменте [126001..133000]

  
  
  5'-[=> yoaE, 14-1087]--------------------------------------------------------------------[=> yoaH, 5398-5652]----------------------3'
  
  3'---------------------[<=sdaA, 1262-2605]-------[<=yeaB, 3208-3783]-[<=pabB, 3841-5223]-----------------------[<=purT, 5746-6921]-5'
  
  

  где значки => и <= обозначают прямую или комплементарную цепь ДНК соответственно, четырехсимвольный код - название самого сходного гена у E. coli, а координаты - местонахождение границ открытой рамки в данном фрагменте.

• Сравнение взаимного расположения предсказанных генов в исследуемом фрагменте и сходных аннотированных генов E. coli.

  Расположение найденных генов у E. coli. на фрагменте [1880001..1950000]

  
  
  3'-[<= yoaH, 12576-12755]-------------------------------------------------------------------------[<= yoaE, 18053-19609]-------------------------------------5'
                                                                                                                               
  5'-----------------------[=> pabB, 12829-14190]-[=> yeaB, 14194-14712]--[=> sdaA, 14956-16320]----------------------------------------[=> purT, 48905-50083]-3'
  
  

  
  Как видно, группа генов pabB, yeaB, sdaA идут в одинаковом порядке как на хромосоме E. coli, так и на хромосоме Yersinia intermedia. (на двух схемах они условно изображены в разном направлении). В целом взаимное расположение генов pabB, yeaB, sdaA, yoaH, yoaE совпадает в обоих случаях.
  Все найденные гены, кроме purT, лежат в интервале длиной 7000 bp на обоих хромосомах.
  Такое сходство отдедьных участков геномов говорит о близком родстве данных двух бактерий.
  Действительно, они даже принадлежат одному семейству - Enterobacteriaceae.

Интересно, что...

• ...если для выполнения данной задачи взять не бактериальный генетический код, а стандартный, то cуммарное число найденных ORF, будет равно 10, против 16 в случае бактериального(лист if standart code книги). Возможно, это связано с тем, что в бактериальном генетическом коде имеются альтернативные кодоны, с которых может начаться синтез белка, т.е. старт кодон - не только метионин (AUG), но и GUG, UUG, AUU, CUG.
• ... если найти ORF не только на участке [126001..133000] данной записи, но на всей ее протяженности,то можно обнаружить, что там встречаются последовательности, для которых находятся более 80-ти сходных из E. coli. Причем в описании каждого из найденных гомологов (в случае, если их так много) сказано, что он ATP-binding (АТФ-связывающий), причем большинство из них - транспортные.