Длина: 341 ак
Структура: гомодимер
Доменная организация: 2 структурных и функциональных домена.
(изображение взято из БД PFAM)
N-концевой домен(LacI) содержит "спираль-поворот-спираль" мотив(HTH) для связывания с ДНК
С-концевой домен(Peripla_BP_1) содержит лиганд-связывающий мотив
оба домена соединены петлей, которая также важна для связывания с ДНК, эту последовательность могут
расщеплять протеазы, если белок не связан с ДНК.
Семейство: GalR/LacI
Реакция: PurR + hypoxanthine = PurR-hypoxanthine (связывание с гипоксантином)
Функция: регулирует транскрипцию нескольких генов, которые участвуют в биосинтезе пуриновых
и пиримидиновых нуклеотидов, а также в его собственном синтезе.
Эффектор(корепрессор): гипоксантин или гуанин(продукты пуринового метаболизма)
(картинки взяты из БД KEGG)
связывание приводит к конформационным изменениям, что позволяет белку связаться с ДНК
сайт связывания состоит из 16 нуклеотидов: консенсус этой последовательности 5'-ACGCAAACGTTTTCNT-3'(инвертированный повтор)
Создание хорошего множественного выравнивания эффекторсвязывающих доменов группы белков purr
На сайте БД PFAM находим доменную структуру белка-прототипа purR_Ecoli..
Peripla_BP_1 - эффекторсвязывающий домен.
На странице с описанием этого домена получили выравнивание
всех эффекторсвязывающих доменов в fasta-формате.
Для получения выравнивания доменов, заданных в purr, был написан скрипт purr.scr.
В результате получили файл PF00532_purr.fasta с множественным выравниванием эффекторсвязывающих доменов группы специфичности purr.
Создание единого множественного выравнивания заданных доменов всех групп специфичности
В GeneDoc экспортировали все группы специфичности, группируя и размечая их разными цветами при добавлении. Полученное выранивание в файле effectorbind.msfПосмотреть изображение.
В полученном выравнивании одна консервативная позиция для всех групп специфичности - 146; позиция 112 является консервативной для всех, кроме ptxs; Группы расположены в следующем порядке: purr, frur, galss, gntr, laci, mali, ptxs, rbsr, scrr, thur_raft, trer.
В группе purr консервативными позициями являются 31-36, 39, 52, 57, 59, 61, 64, 65, 68, 69, 72-75, 101, 103, 104, 107-112, 114, 115, 131, 142, 143, 146-151, 167, 170, 175, 177, 179, 180,
182,190, 191, 197, 202, 204, 209, 217, 221, 222, 224, 225, 230, 233, 243, 244, 247, 250, 253, 255, 278, 279, 283-286, 289, 291-293, 296, 301, 304, 308, 310, 311, 313, 314, 322-328, 337, 338, 340, 342-247, 349, 352, 353, 356, 359, 360, 363, 364.
Всего 107 позиций. Такое большое количество консервативных позиций говорит о том, что белок высоко специфичен.
Тоже самое выполнили для ДНК-связывающего домена.
Полученное выранивание в файле dnabind.msf
Посмотреть изображение.
На изображении черным выделены консервативные позиции для всех групп: 43, 46, 63, 72.
Позиция 44 является консервативной в пределах каждой группы.
Создание лого-изображения полного выравнивания заданных доменов и выравнивания доменов заданной группы специфичности.
Используя ресурс WebLogo были получены следующие лого-изображения(гэпов нет).для эффекторсвязывающих доменов группы специфичности purr
Посмотреть изображение.
для всех эффекторсвязывающих доменов
Посмотреть изображение.
Создание профиля множественного выравнивания для доменов с заданной специфичностью purr
1) Расчет веса последовательностей выборки c помощью программы pfw пакета PFTOOLS.
Команда:
pfw -m dnabind_purr.fasta > dnabind_purr_weighted.fasta
pfw -m effectbind_purr.fasta > effectbind_purr_weighted.fasta
2) По взвешенному выравниванию строим профиль с помощью pfmake.
Команда:
pfmake -m dnabind_purr_weighted.fasta /usr/share/pftools23/blosum45.cmp > dna_profile.prf
pfmake -m effectbind_purr_weighted.fasta /usr/share/pftools23/blosum45.cmp > effector_profile.prf
3) Затем нормируем профиль с помощью autoscale.
Команда:
autoscale -m effector_profile.prf > effector_profile_scaled.prf
autoscale -m dna_profile.prf > dna_profile_scaled.prf
Поиск белков со специфичностью purr по протеому Xanthomonas campestris pv. campestris (strain B100).
Протеом Xanthomonas campestris pv. campestris (strain B100) был получен из БД UniProt/Trembl.
C помощью программы pfsearch пакета PFTOOLS был проведен поиск белков со специфичностью purr по протеому Xanthomonas campestris pv. campestris (strain B100).
Команда:
pfsearch -C 15.0 -f effector_profile_scaled.prf Xanthomonas_campestris.fasta > effector_15.search
pfsearch -C 15.0 -f dna_profile_scaled.prf Xanthomonas_campestris.fasta > dna_15.search
Поиск был проведен с различными значениями порога (5, 10, 15, 20, 30). При значении порога равным 15 в случае ДНК-связывающих доменов был найден единственный белок
B0RLC9_XANCB, который также был найден при аналогичном поиске эффекторсвязывающих доменов (всего находок 10). Будем рассматривать результаты с порогом 15.
Последовательности найденных белков: effector_found.fasta и
dna_found.fasta.
С помощью программы ClustalW2 построили выравнивание полученных последовательностей для ДНК-связывающих и эффекторсвязывающих доменов с уже имеющимся
для группы специфичности purr, импортировали его в GeneDoc:
effector_aln.msf и dna_aln.msf.
Эффекторсвязывающий домен
Красным цветом выделены белки группы специфичности purr, черным показаны консервативные позиции (всего 16), они являются консервативными и для всей группы. В позиции 369 только у белка B0RLC9_XANCB стоит Y, как в группе специфичности.
Была исследована структура белка прототипа (PDB ID - 1BDH), оказалось, что выделенные консервативные позиции не имеют никакого отношения к сайту связывания с эффектором. Аминокислотные остатки, которые взаимодействуют с эффектором, в файле hpa.pdb.
ДНК-связывающий домен
Из 31 консервативных аминокислотных остатков только 7 взаимодействуют с ДНК, при том, что просмотр структуры показывает, что есть другие аминокислотные остатки, взаимодействующие с ДНК. Аминокислотные остатки, которые взаимодействуют с ДНК по данным айла 1BDH.pdb в dna.pdb.
Таким образом, приходим к выводу, что из полученных белков ни один не принадлежит группе специфичности purr.
© Ксения Лежнина 2008