Сравнение фрагмента полного множественного выравнивания, полученного с помощью ClustalW, с соответствующим фрагментом "эталонного" выравнивания из SMART.

1. P5CS1_ARATH, дельта 1-пирролин-5-карбоксилат синтаза А, код доступа P54887 (15-260)
2. CBK_TRIVA, карбамат киназа, код доступа О96432 (1-295)
3. CPKA_PYRHO, карбамат киназа, код доступа О59023 (3-296)
4. ARCC_BACLD, карбамат киназа, код доступа O86134 (4-297)
5. ARGB_SYNY3, карбамат киназа, код доступа P74733 (32-269)

Рис.1 Изображение эталонного выравнивания, полученного программой PFAM (домен AAkinase оказался PFAM'овским, отчего выравнивание последовательностей получал из БД PFAM'а). Раскраска приведена по консервативным аминокислотам.

Рис.2 Изображение фрагмента полного множественного выравнивания, полученного с помощью программы ClustalW. Розовым цветом выделены участки белков из эталонного выравнивания. Синим выделены фрагменты четырех последовательностей (CBK_TRIA, CPKA_PYRHO, ARCC_BACLD, ARGB_SUNY3), совпавшие с соответствующими позициями эталонного выравнивания . Оранжевым выделены столбцы множественного выравнивания последовательностей CBK_TRIVA, CPKA_PYRHO, ARCC_BACLD, совпадающие со столбцами эталонного выравнивания (см. рис.1).

Результаты выполнения задания:

Число колонок во фрагменте из PFAM для всех пяти белков (включая столбцы с гэпами): 65
Число колонок, совпавших с колонками в файле clustalw.msf: 0
Видно,что для всех последовательностей таких колонок не нашлось.
Но идентичные колонки в эталонном выравнивании и выравнивании ClustalW можно найти для четырех белков: 
CBK_TRIVA, CPKA_PYRHO, ARCC_BACLD, ARGB_SYNY3
На рис.2 такие идентичные колонки выделены синим цветом.
Число колонок во фрагменте из PFAM для этих четырех белков: 65
Число колонок, совпавших с колонками в файле clustalw.msf для четырех белков: 34
Тогда мера сходства для выравниваний этих четырех белков равно 34/65*100% = 52,3%
Также идентичные колонки в эталонном выравнивании и выравнивании ClustalW можно найти и для трех белков: 
CBK_TRIVA, CPKA_PYRHO, ARCC_BACLD
На рис.2 такие идентичные колонки выделены орнжевым цветом.
Число колонок во фрагменте из PFAM для трех белков: 65
Число колонок, совпавших с колонками в файле clustalw.msf для трех белков: 55
Тогда мера сходства для выравниваний этих четырех белков равно 55/65*100% = 84,6%

1. Во-первых, очевидно, что алгоритмы выравниваний разные, так как результаты несколько отличны. Бросается в глаза то, что в эталонном выравнивании намного больше гэпов, чем в выравнивании ClustalW. Очевидно, это связано с тем, что для построения выравнивания Clustal'ом были использованы полные последовательности белков, а не фрагменты, отвечающие за домены в этих структурах. Причем, как мне кажется, в эталонном выравнивании большую роль может играть структурный аспект: так как для некоторых белков семейства известны структуры, то наиболее выгодно в плане достоверности выравнивания будет сперва сделать структурное выравнивание белков с известными структурами, а затем сделать глобальное выравнивание всех членов семейства. Тогда вручную "мсправляя" глобальное выравнивание в соответствии со структурным, можно добиться того, что с большей вероятностью будет определены: а) границы доменов, б) структурные элементы и др. Мне кажется, что по такой логике построены локальные (потому что не входящие в домен остатки просто отрезаны от последовательности белка) эталонные выравнивания в PFAM'е. Когда же мы строим выравнивание Clustal'ом, то мы не задаем ему данных о доменной организации белков, сведений о структурных элементах: программа с помощью своего алгоритма лишь ищет подобные элементы (кластеры) в белках. Поэтому, вполне возможны отклонения от идеального выравнивания, но как можно убедиться на опыте, все же выравнивания Clustalw вполне приличные.
2. Во-вторых, возможная причина несовпадений с первой последовательностью - слишком "длинный" сигнальный пептид в самом начале выравнивания, когда у других последовательностей он намного короче. Действительно, так как Clustal выровнял полные последовательности, то ошибка в выравнивании началась с первых аминокислот по случайным причинам: неправильно определены концы сигнальных пептидов, или просто не верно определены кластеры аминокислот, по сравнению с эталоном - все это могло повлечь усиление ошибки в следующих участках выравнивания.
3. В-третьих, может быть, в базах данных PFAM и SwissProt разное описание белков, или содержат последовательности с/без сигнального пептида, отчего Clustalw просто выравниваниет нецелые последовательности белков.
   
   

   Матрицы попарного совпадения.

   Рис.3 Матрица попарного совпадения для эталонного выравнивания.

   

   Рис.4 Матрица попарного совпадения для выравнивания ClustalW.

   
   С помощью программы GENEDOC были получены матрицы попарного совпадения для эталонного выравнивания и для участка множественного выравнивания Clustalw, соответствующего эталонному выравниванию (рис. 3, 4). Матрицы содержат информацию о количестве идентичных позиций для каждой пары последовательностей. Например, наиболее сходными участками последовательностей эталонного выравнивания являются участки последовательностей CPKA_PYRHO и ARCC_BACLD (процент идентичных позиций составляет 62%), а наименее сходными участками - участки последовательностей ARGB_SYNY3 и ARCC_BACLD (процент идентичных позиций составляет 17%). Хочу заметить, что при сравнении обеих матриц, бросается в глаза следующее:
   1. Процент попарных совпадений для всех последовательностей меньше для выравнивания ClustalW, чем для эталонного. На мой взгляд это связано с тем, что ClustalW построил глобальное выравнивание, а не локальное, как в эталонном (как мы знаем в эталонном выравнивании использованы лишь домены белков). А как мы знаем, глобальное выравнивание не всегда отражает действительность и часто имеет заниженные веса, нежели локальное (из-за лишних гэпов).
   2. Особенно сильно занижен процент попарных совпадений для пар P5CS1_ARATH - (все остальные белки) в выравнивании ClustalW по сравнению с эталонным. И при этом в самом выравнивании ClustalW участок этого белка, который есть в эталонном выравнивании, не совпал с другими фрагментами из других белков, что нашло отражение в процентах попарных совпадений. Я думаю, что здесь действительно есть прямая закономерность, но при этом важно то, чтобы участок в эталонном выравнивании нес хорошую консервативность, чтобы при построении других выравниваний, можно было отследить динамику процентов идентичности. Ведь для консервативных фрагментов выравнивания эти величины будут высокими, а при определенных изменениях в выравнивании (или построении нового, но с другим алгоритмом) можно с большой вероятностью ожидать либо близкие к эталонным значения (значит новое выравнивание хорошо "угадало" консервативный участок), либо сильно отличные (промах). Таким образом можно с помощью сравнения чисел попарного совпадения для эталонного выравнивания и нового оценивать, например, качество алгоритма, используемого для построения нового выравнивания.

      ---

      ©Володя Рудько