Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://kodomo.cmm.msu.ru/~vovan/Ligand.html
Дата изменения: Mon Dec 19 17:34:46 2005
Дата индексирования: Mon Oct 1 22:53:26 2012
Кодировка: Windows-1251

Ligands
На главную страницу первого семестра.

Изображение области связывания аденинрибонуклеотид дифосфата и N–ацетил–L–глутамата с N-ацетил-L-глутаматкиназой.

РИС 1. Область связывания аденинрибонуклеотиддифосфата (далее ADP) с белком.
условные обозначения:
Желтым цветом, и подписанные под номером 1, выделены аминокислоты белка, наиболее важные для связывания ADP.
Зеленым выделены менее важные аминокислоты и подписанны под номером 2.
Фиолетовым выделены остальные аминокислоты зоны контакта белка с NAGK.
Голубым выделен углеродный остов ADP.
Белок представлен в остовной модели.
Зона контакта представлена в вандерваальсовой модели.

РИС 2.Область связывания субстрата N–ацетил–L–глутамата (далее NLG) с белком.
условные обозначения:
Желтым цветом, и подписанные под номером 1, выделены аминокислоты белка, наиболее важные для связывания NLG.
Зеленым выделены менее важные аминокислоты и подписанны под номером 2.
Голубым выделен углеродный остов NLG.
Фиолетовым выделены остальные аминокислоты зоны контакта белка с NLG.
Белок представлен в остовной модели.
Зона контакта представлена в вандерваальсовой модели.

Метод определения контактов.

В программе RASMOL использовались команды SELECT WITHIN (5.0, ADP) и SELECT WITHIN (5.0, NLG) для выделения 5-ти ангстремной области вокруг моих литандов.
Затем методом предположения и исключения оставлены вышеизображенные аминокислотные остатки.
Остальные аминокислоты удалены, с использованием команды RESTRICT.
Множество аминокислот контактов ADP и NLG определено командой DEFINE именами cont_A_ADP и cont_A_NLG соответственно.
Использованием разных комбинаций команд RASMOL для отображения атомов и молекул, выполнены по 5-6 скриптов на каждый лиганд, разделенных командой PAUSE, показывающих зону контакта белка с ADP и NLG.

Описание генноинженерного эксперимента.

1. Замена аминокислотного остатка белка, которая может привести к потере способности связывания N-ацетил-L-глутамат киназой (далее NAGK) с ADP(1) или практически не повлияет на связывание NAGK c ADP(2).

Список аминокислотных остатков NAGK, контактирующих с ADP.

LYS 8A^*	GLY 10A	GLY 11A	ASP 162A
SER 180A	LEU 186A	ILE 209A	ILE 210A
THR 211A	ASP 212A	GLY 213A	MET 214A
LYS 217A	LYS 61A

* связь реализуется через водяной мостик.

  В ближайшем рассмотрении нуклеотид–связывавющий сайт содержит 14 аминокислотных остатков, сближенных в трехмерной структуре белка, но не все из них связывают ADP.
  Из них я выделил наиболее важные, лимитирующие субстрат–специфичность и связываемость (за счет Е связи, геометрии и др.), и наименее важные.
Для получения дополнительной информации смотритеизображение контакта ADP c белком.
  Рассмотрим выделенные мною остатки поближе.
  Leu1 — лейцин 186А — я определил как "важную" аминокислоту, потому что:
1. Аминокислотный остаток дает две водородные связи.
2. В пространственной упаковке он расположен перед сайтом связывания, и его боковой радикал словно прикрывает молекулу аденина (например от воды) но при этом не загораживает проход для нее к своему сайту. Поэтому если его заменить на аминокислоту с большим радикалом, возможность пройти объемной молекуле АДФа резко упадет. Действительно, при грубом приближении расстояние между двумя метильными группами лейцина составляет = 2,5Å, если заменить на триптофан, то расстояние между С1 и С2 составит около 4,23Å, что уже существенно.
При замене на триптофан, скорее всего изменится пространственная упаковка этой петли и причем вероятнее всего так, чтобы спрятать Trp во внутрь глобулы (гидрофобная аминокислота), то можно ожидать потерю в связывании ADP с белком двух водородных связей (около 6–8 кДж/моль).
Замена лейцина на гидрофильную аминокислоту, на мой взгляд, может вызвать локальное расплетение участка в сторону большей направленности остатка в воду.
  Поэтому, я предлагаю мутацию на триптофан Trp.
  Меt1 — метионин 214А — выбрал за "важную" аминокислоту, так как:
1. остаток метионина, из-за гидрофобности его боковой группы, участвует в гидрофобных и Вандерваальсовых взаимодействиях с пуриновым кольцом [на мой взгляд здесь имеется довольно сильное взаимодействие за счет пуринового кольца, электроны которого могут, под действием электрического (хотя в ЯМР–спектроскопии — магнитного, поэтому не уверен) поля электронов метионина индуцировать кольцевой ток — иначе говоря согласованное колебание электронов]. Я бы определил этот метионин как "липучка", некий "липкий сайт" скрепления АДФ.
2. Из геометрических соображений. Боковой радикал метионина уложен очень плотно и компактно, расстояние между пурином и остатком от 3,5Å до 3,8Å, что приблизительно составляет два вандерваальсовых радиуса атома С: 3,4Å.
Из этих домыслов следует, что практически любая мутация метионина может вызвать потерю связывания.(см. страница изображение контакта ADP c метионином.).
Замена на Leu, Phe, Ile и др. аминокислоты с крупной боковой группой однозначно приведет к потере связывания — АДФ не влезет в свой карман связывания. Замена на аминокислоты с меньшим размером боковой группы, но также гидрофобные (Ala, Val) также плохо из–за уменьшения гидрофобной поверхности — площади соприкосновения с АДФ. Замену на гидрофильные аминокислоты, мне кажется, не стоит обсуждать, так как очевидно, что никаких гидрофобных взаимодействий в этом случае не будет.
  Поэтому, предлагаемая замена — Phe или Glu.
  Lys1 — лизин 217А — выбрал за "важную" аминокислоту, так как:
1. расположена внутри белка и образует водородную связь с кислородом фосфорной группы — богатой электронами группы вследствие резонанса. Таким образом, связь довольно крепкая и специфичная.
2. Lys имеет двойственную природу — он амфифилен, так как имеет длинный гидрофобный хвост (4,4Å от С– α до ε–NH₂ группы) и гидрофильную головку — NH₂ — группу.
3. Также еще более укрепляет связывание β – фосфорной группы за счет водородных связей с водой, которая в свою очередь координируется с О–атомом фосфатной группы.(cм. страница изображение контакта ADP c лизином 217А и лизином 8А.
4. Аминокислотный остаток включен в образование α – спирали, которая в большей части образует гидрофобное ядро (лишь концевые аминокислотные остатки доступны воде).
Это обуславливает плотную упаковку боковой группы аминокислот по принципу Pazzle — каждый занимает строго определенное место в пространстве с максимальной реализацией всех связей. А это сильно ограничивает круг возможных альтернативных мутаций.
  Из этих соображений гидрофильная мутация (Asn, Asp, Ser и др) приводит к потере связывания из–за малой длины боковых групп и часто недонорного характера гидрофильной группы.
Гидрофобная мутация с большим радикалом тем более не возможна из–за нарушений в упаковке белка и либо отсутствия (Phe), либо не подходящей геометрии (Trp, His, Tyr) донорного атома.
Возможная мутация на аналог —Arg — также отпадает: у него боковая группа больше (6,25Å от С–α до С–ζ атома) и содержит два донорных атома азота, a держать потенциально протонированную группу не насыщенной водородными или солевыми связями в гидрофобном окружении белка крайне невыгодно
(следствие закона Кулона: Е(заряженой сферы в воде [ε = 80]) = q²/(80*2*r), а E(заряженной сферы в белке [ε = 3]) = q²/(3*2*r), то ΔG = 40ккал/моль {при r_cфера=1.5Å }— крайне не выгодный процесс!!!(взято из А.В. Финкельштейн О.Б. Птицын "Физика белка"). Также упаковать объемную гуанидиловую группу в глубоко расположенном кармане рядом с активным центром без каких-либо изменений для активности белка невозможно.
  Lys2 — лизин 61А — я отнес к менее важной аминокислоте, так как:
1. расположена сбоку от молекулы АДФ и радикал лизина никак не влияет на ее связывание в кармане.
2. образует одну водородную связь, и ту за счет молекулы воды, связанной с кислородом фосфорной группы.
3. аминокислотный остаток выставлен на поверхности белка.(Смотреть изображение контакта ADP c белком.)
  Из этих соображений следует, что любые мутации мало повлияют на связывание нуклеотида.
Гидрофильные — никак не скажутся, так как боковая группа аминокислоты выставлена на поверхности белка.
Гидрофобные — все зависит от размера гидрофобного радикала. Если он небольшого размера (Val, Ala, etc) — влияния практически никакого, так как лизин находится в наиболее растянутой конформации — 6,31Å — максимальное удаление от С – α атома до бокового радикала, и малые радикалы аминокислот прекрасно впишутся в место Lys. Если радикал большой — влияние будет, но малое. Скорее всего, даже почти не затронет сайта связывания АДФ — "локальные потрясения пройдут стороной".

2. Замена аминокислотного остатка белка, которая может привести к потере способности связывания NAGK c NLG(1) и мало влияющая на способность связывания с NLG(2).

Как видно из рисунка (также cм. вторичная структура NAGK) NLG связывается в кармане, сформированном на С–конце S1 и S2 — тяжей главного β – листа.
NLG — карман закрыт от растворителя аминокислотными остатками α – спиралей H3 и H4 и S3, S4 тяжей, образующих β – шпильку — конструкция напоминающая крышку над субстратом. С N—конца субстрат прикрыт S6 — S7 шпилькой, тем самым предотвращая доступ субстрата к воде.
Рассмотрим аминокислоты связывающего центра.
1. Cписок аминокислотных остатков NAGK, контактирующих с NLG.

GLY A43	GLY A44	GLY A45	LEU A65
ARG A66	ASN A158	ASN A160^*	ALA A161
VAL A122	LYS A61	LEU A80

*связь реализуется через водяной мостик.
(Картину связывания NLG с белком см. здесь.)
  Как видите на рисунке выше, я определил за "важные" следующие аминокислоты:
1) Arg 66А (далее Arg1). На мой взгляд, в случае с аргинином все кристально ясно.
а) Arg образует одну водородную связь с С–О группой ацетилового остатка NLG и N1 Arg а также очень прочный солевой мост с α – СОО^– группой субстрата и гуанидиновой группой аргинина.
б) Боковая группа Arg находится в растянутой конформации, т.е. радикал аминокислоты вытянут на 6,07Å.
в)Так же Arg, по–моему, обуславливает специфичность фермента к NLG: если взять неацилированный глутамат, то электростатическое отталкивание α – аминогруппы с гуанидиновой группировкой приведет к несвязыванию субстрата.
  Поэтому, если заменить этот остаток на гидрофобную аминокислоту — теряются важные связи, отчего субстрат явно не свяжется в своем кармане.
Если провести замену на гидрофильную аминокислоту, все будет определяться природой замены. Если радикал с отрицательной группой (Asp, Glu), то явно произойдет потеря связывания, так как связь образовывалась положительно заряженной группой. Если радикал с положительной группой (His, Lys), все зависит от размера боковой группы: His, Trp не пойдут, так как значительна гидрофобность остатков и расстояние от С – α до донорной группы меньше, чем необходимо (6,07Å). В принципе, возможна замена на лизин, но тогда произойдет потеря делокализации положительного заряда у протонированной гуанидиновой группы, имеющейся у аргинина.
  Поэтому, предлагаю возможную мутацию: Phe — приведет к потере связывания с субстратом.
2) Asn 158A (далее Asn1).
a) Остаток образует две водородные связи с NLG, причем разной, так скажем, "полярности": у одной связи акцептор со стороны Asn, а донор — NLG, у другой — донор у Asn, акцептор — NLG.
б) Расположен "сверху", над аминоацилглутаматом, плотно прилегая к субстрату.
  Таким образом, не каждый остаток подойдет конформационно, по размерам, и также не каждый остаток создает такую специфическую полярность связей, имея и донор, и акцептор водородной связи в одной части аминокислоты.
Соответственно, гидрофобная замена приведет к потере связывания с NLG, особенно если аминокислота содержит объемный гидрофобный радикал (Phe, Tyr, Trp).
Гидрофильная мутация может различно повлиять на связывание субстрата. Аминокислоты с длинным боковым радикалом (Lys, Arg) приведут к невозможности связать NLG, с короткой боковой группой (Ser, Thr), возможно, уменьшат сродство субстрата к ферменту.
  Поэтому, предлагаемая замена — триптофан, субстрат точно не свяжется со своим сайтом связывания.
Роль обсужденных выше аминокислот отображена на странице "водородные связи между NLG, аргинином и лейцином".
3) За аминокислоту, чья мутация мало повлияет на связывание NLG, я выбрал Leu80A или Leu2, так как:
а) Остаток расположен довольно вдалеке от субстрата.
б) Боковой радикал лейцина имеет растянутую конформацию, контактируя с NLG только концевыми метильными группами, позволяя расположиться возможным мутациям этой аминокислоты в пространстве, не мешая связыванию NLG.
Поэтому возможно любая мутация этого остатка мало повлияет на связывание субстрата со своим сайтом.
  Предлагаемая мутация — Gly — точно никак не скажется на ферментное сродство к субстрату.

Список использованной литературы:

А.В. Финкельштейн О.Б. Птицын "Физика белка"
Carl Branden, John Tooze "Introduction to Protein Structure"
М. Диксон, Э. Уэбб "Ферменты"