Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://kodomo.cmm.msu.ru/~vershina/t5.files/report.doc Дата изменения: Tue Dec 26 01:54:33 2006 Дата индексирования: Tue Oct 2 11:41:32 2012 Кодировка: koi8-r

Моделирование структуры белка-предшественника лизоцима
1с46 по гомологии с белком 1lmp.
Авторы
Карпусь Ольга, Юминова Алина
Введение
Лизоцим - фермент класса гидролаз (EC 3.2.1.17), катализирующий
гидролиз гликозидной связи между N-ацетилмурамовой кислотой и N-ацетил-
глюкозамином. В высокой концентрации, приблизительно 3 % от общего
количества белков клетки, лизозим присутствует в яичном белке цыпленка.
Впервые лизоцим был описан в 1922 Александром Флемингом. Этот
фермент был обнаружен случайно в лаборатории Флеминга: капли против
насморка попали в чашку Петри с бактериальной культурой, и клетки
разрушились. Это явление было тщательно исследовано, и главный действующий
фермент был идентифицирован как лизоцим.
В 1965 структура лизоцима была решена методом рентгеноструктурного
анализа (разрешение 2е) Дэвидом Чайлтоном Филлипсом. Много лет лизоцим -
лучший объект для рентгеноструктурного анализа из-за уникальных свойств
этого фермента. Прежде всего, лизоцим легко очистить от яичного белка. Во-
вторых, этот белок кристаллизовать значительно легче, чем большинство
других. И наконец, кристаллы Лизозима позволяют добиваться высокого
разрешения.
Лизоцим - основный (изоэлектрическая зона около 11) белок с
молекулярной массой около 14 700; единственная полипептидная цепь состоит
из 127-130 аминокислотных остатков и свёрнута в компактную глобулу. На N-
конце полипептида располагается лизин, на С-конце - лейцин. Трёхмерная
конформация полипептидной цепи поддерживается 4 дисульфидными связями. (В
лизоциме молока человека их 3, яичного белка гуся - 2, в лизоциме фага Т4
их нет; чем больше дисульфидных групп, тем лизоциме более устойчив, но
менее активен.) Глобула Л. состоит из двух частей, разделённых щелью; в
одной части большинство аминокислот (лейцин, изолейцин, триптофан и др.)
содержит гидрофобные группы, в др. преобладают аминокислоты (лизин,
аргинин, аспарагиновая к-та и др.) с полярными группами. Полярность
окружения влияет на ионизацию двух карбоксильных групп, расположенных на
поверхности щели молекулы с разных её сторон. Стабилен в кислой среде и
утрачивает ферментативную активность в нейтральных и щелочных р-рах,
особенно при нагревании. Устойчив к действию протеаз.
Лизоцим действует на один из основных компонентов бактериальной
стенки - сложный полисахарид, состоящий из двух типов аминосахаров.
Полисахарид сорбируется на молекуле лизоцима в щели на границе гидрофобной
и гидрофильной её частей таким образом, что с ферментом связывается 6 колец
аминосахаров, а одна из соединяющих их гликозидных связей (между 4 и 5
кольцами) оказывается между карбоксилами. Благодаря взаимодействиям между
карбоксилами Л. и атомами, образующими гликозидную связь, а также искажению
валентных углов субстрата, происходит активация и разрыв связи. Это ведёт к
разрушению оболочки бактериальной клетки. Широко распространен в природе:
от бактериальных вирусов до человека. У людей находится в секретах кожи и
слизистых оболочек, крови, молоке, сперме, лизосомах клеток, особенно
фагоцитарных. Синтезируется макрофагами и полиморфноядерными лейкоцитами.
Много лизоцима, помимо белка яиц, содержится в соке редьки, хрена, репы.
При определенных инфекционных, онкологических и иных заболеваниях
происходит изменение лизоцимной активности жидкостей, что используют в
диагностических целях. В медицине Л. применяют чаще как местное (0,05 -
0,25% р-ры) антибактериальное средство, иногда в сочетании с пенициллинами,
при септических состояниях, нагноительных процессах, ожогах, отморожениях,
конъюнктивитах и кератитах, гайморитах и ринитах, вызванных чувствительными
к нему бактериями.
Аннотация
На основании последовательности белка из организма Miopithecus
talapoin и структуры белка-гомолога построена модель структуры изучаемого
белка. С полученной структурой проведены симуляции молекулярной динамики
(свободный белок и комплекс с лигандом). Траектории молекулярной динамики
проанализированы с целью получения информации о свойствах системы.
Материалы и методы
Симуляцию молекулярной динамики лизоцима в свободном состоянии и в
комплексе с олигосахаридом проводили с использованием пакета программ
GROMACS 3.2.1. Молекулу белка (комплекса) помещали в кубический бокс,
наполненный SPC. Заряд системы был нейтрализован ионами Cl-. В конечном
счете система состояла:
. в случае белка в свободном состоянии: 1347 атомов белка, 4 атома
Cl, 17856 атомов воды, всего 19185 атомов
. в случае комплекса белка с лигандом: 1347 атомов белка, 4 атома
Cl, 56 атомов олигосахарида, 17733 атома воды, всего 19116 атомов
Система была смоделирована с использованием силового поля GMX.
Симуляция молекулярной динамики лизоцима в свободном состоянии проводилась
в течение 133 пс с шагом 2 фс при постоянном давлении 1 бар и постоянной
температуре 300 К, для контроля температуры использовался алгоритм
Беренденсена. Электростатические взаимодействия были посчитаны с
использованием метода двойного обрезания (Cut-off). Для ограничения длин
всех связей был использован алгоритм LINCS. Симуляция молекулярной динамики
комплекса лизоцима с лигандом проводилась в течение 133 пс с теми же
параметрами.

Результаты и обсуждение
1. Изменения среднеквадратичного отклонения структуры от времени
[pic]
Как видно из полученных графиков, ни в случае свободного белка, ни в его
комплексе с лигандом система не достигла равновесия. Впрочем, это может
быть связано с недостатком времени молекуярной динамики (133 пс).
2. Флуктуации отклонения атомов белка во времени.
[pic]
Видно, что амплитуда движений атомов белка в свободном состоянии иногда
превышает, но чаще меньше амплитуды движения атомов белка в комплексе, т.е.
атомы в комплексе с лигандом более подвижны. Это значит, что лиганд не
эффективно связывается с белком.
Об этом говорит и график изменения количества водородных связей белка и
лиганда во времени.
3. Изменение количества водородных связей белка и лиганда во времени.
[pic]
Судя по графику, никакого взаимодействия лиганда с белком не происходило:
количество водородных связей колеблется от 0 до1. Рисунок взаимодействия
белка и лиганда подтверждает эти утверждения (см. рис.1).
[pic]
Рис.1. «Взаимодействие» лиганда с белком.
4. Изменение поверхности белка и комплекса во времени.
[pic]
[pic]
Можно видеть, что в изучаемом белке общая поверхность примерно наполовину
гидрофильна и наполовину - гидрофобна. Эти значения сохраняются на всей
длине траектории. Величина общей поверхности белка в свободном состоянии
меняется за время симуляции. Поверхность белка в комплексе за все время
симуляции остается примерно постоянной. Может ли это говорить о какой-то
стабилизации? Вряд ли, просто белок за время динамики не взаимодействовал
с лигандом.
5) Изменения потенциальной энергии и температуры
[pic]
За время динамики потенциальная энергия комплекса незначительно колеблется
на уровне -24000 кДж/моль. Колебания потенциальной энергии белка намного
значительнее - между -242000 и 24000 кДж/моль.
[pic]
Температура комплекса колеблется от 302 К до 311 К, свободного белка - от
304 К до 311 К. Возрастание и снижение температуры не имеет четких
закономерностей, поэтому такое изменение температуры можно считать нормой.
Выводы
1. Построена модель структуры лизоцима C 1c46 на основании его
последовательности и известной структуры гомолога.
2. Качество модели неудовлетворительное, т.к. лиганд оказался не
связанным с белком и вся структура не уравновешивается со временем.
3. Однако в целом симуляции молекулярной динамики прошли успешно, анализ
флуктуаций, энергии и температуры не выявил никаких аномальных
значений.
4. Получены описания поверхности белка: примерно наполовину она
гидрофильна, наполовину - гидрофобна.