Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://kodomo.cmm.msu.ru/FBB/StudentScience/diplom_2007/Kochetov.doc Дата изменения: Mon Apr 9 17:14:10 2007 Дата индексирования: Sat Dec 22 07:08:51 2007 Кодировка: koi8-r

КИНЕТИЧЕСКИЙ МЕХАНИЗМ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ
ТРАНСКЕТОЛАЗЫ.





Транскетолаза является типичным и простейшим представителем
тиаминдифосфат-зависимых ферментов. Катализирует обратимый перенос
двууглеродного фрагмента, остатка гликольальдегида, с кетосахаров
(субстат-донор) на альдосахара (субстрат-акцептор). Общая структура
транскетолазы и ее активного центра достаточно хорошо изучены Что
касается кинетического механизма функционирования фермента, механизма
его взаимодействия с коферментом, механизма взаимодействия с
субстратами и их последующего превращения, то эти вопросы до
последнего времени оставались, по существу, не изученными.

Несколько лет тому назад мы начали их изучение, поставив перед
аспирантом задачу исследовать механизм связывания кофермента,
тиаминдифосфата с апотранскетолазой. В результате проведенной работы была
разработана модель с взаимодействующими лиганд-связывающими центрами в
димерной молекуле белка. В рамках этой модели составлены кинетические
уравнения, описывающие кинетику связывания тиаминдифосфата с с
апотранскетолазой. Определены константы скорости индивидуальных стадий
процесса образования каталитически активного холофермента из апо- и
кофермента при использовании ионов кальция и магния в качестве кофакторов,
в отсутствие и в присутствии субстрата. Полученные аспирантом результаты
оформлены в качестве его диссертационной работы и представлены к защите.
Предлагаемая тема дипломной работы предполагает изучение связывания
субстратов транскетолазы с холоферментом и последующего их каталитического
превращения, разработку кинетической модели транскетолазной реакции,
определение констант ее индивидуальных стадий, идентификацию скорость-
лимитирующей стадии.
Работа будет проводиться с использованием разработанных нами оптических
методов, основанных на характерных изменениях спектра транскетолазы в
результате взаимодействия с субстратом-донором, его расщепления,
образования интермедиата и последующего его переноса на субстрат-акцептор.
Спектрофотометрический метод определения продукта транскетолазной
реакции будет использован для получения кинетических кривых.
Предварительные результаты, полученные по теме дипломной работы:
- показана неэквивалентность активных центров транскетолазы по
связыванию субстрата-акцептора, рибозо-5-фосфата, влияние
двухвалентных катионов на его сродство к ферменту;
- поставлены предварительные опыты с использованием метода stopped-flow
по изучению первой стадии взаимодействия субстрата-донора, ксилулозо-5-
фосфата, с транскетолазой
- .