В настоящей работе процесс сворачивания и самоассоциации при самосборке нативной структуры апоЕ был изучен при одновременном измерении эффективности переноса энергии, анизотропии, интегральной интенсивности флуоресценции и степени доступности флуоресцеиновых хромофоров для анионов тушителя I^-. Выбранная донор-акцепторная пара дансил-флуоресцеин (рис. 1, рис. 2) часто используется при измерении переноса энергии [13,14,18]. Для измерения эффективности переноса была изучена сенсибилизированная флуоресценция акцептора при возбуждении в полосе поглощения донора (рис. 2), а не тушение свечения донора, так как на последний процесс часто оказывают влияние различные посторонние факторы [21]. Нами обнаружен эффективный перенос энергии в растворе между дансил- и флуоресцеин-меченными молекулами апобелка при низких (<0,6 мкМ) концентрациях апоЕ (рис. 3), когда перенос за счет диффузии [21] отсутствует, и регистрируемый процесс может отражать лишь самоассоциацию. Действительно, в жидких растворах перенос между донор-акцепторной парой наблюдается в области концентраций акцептора, обычно превышающих 10^-3 М [21]. В случае взаимодействия донор- и акцептор-меченной молекул перенос энергии зависит от степени мечения акцепторными группами и от геометрии комплекса [18]. Свидетельством существования самоассоцииированной формы апоЕ в растворе служат полученные в нашей работе данные о зависимости величины E от относительного содержания флуоресцеин-меченных молекул апоЕ в донор-акцепторном комплексе (рис. 3) и от степени мечения апобелка флуоресцеином. В то же время, даже при знании геометрии комплекса, можно лишь рассчитать средние межмолекулярные расстояния между индивидуальными молекулами в комплексе [18]. Мы использовали апобелок с большой стехиометрией мечения (4-12 молекул метки/молекулу белка) для измерения возможных изменений расстояния между центрами 'светящихся сфер', т.е. ассоциации/диссоциации, а не для детализации вариаций геометрических форм апобелка при селективном одиночном мечении [18]. Отметим, что при высокой стехиометрии мечения величины r для флуоресценции апоЕ/Ф (см. таблицу) не отличалось от величины анизотропии флуоресценции апобелка, содержащего в среднем меньше 1 молекулы метки/молекулу белка [6], т.е. отсутствовала деполяризация флуоресценции за счет переноса энергии между несколькими молекулами флуоресцеина, расположенными на одиночной молекуле апобелка.

Несмотря на некоторую неопределенность в определении меж- и внутримолекулярных расстояний измерением переноса энергии, связанную в первую очередь с отсутствием информации о величине фактора ориентации k [15,18], такого рода измерения могут быть весьма полезны для быстрого полуколичественного анализа величин расстояний. Тетрамерная форма организации апоЕ в растворе продемонстрирована в нашем предыдущем исследовании [6], а также в работах других авторов [4, 5, 22] с использованием анизотропии флуоресценции апоЕ/F [6], гель-фильтрации [5,6,22], 'сшивающих' агентов (рис. 4, [5,6]) и седиментационного анализа [5].

Существенно более выраженное снижение интенсивности флуоресценции флуоресцеиновых групп при холодовой ренатурации апобелка, после его денатурации гуанидин-гидрохлоридом (данные не приведены) или после мономеризации холатом Na (см. таблицу), по сравнению с изменением интенсивности свечения при инкубации при 24њС указывает на наличие промежуточной стадии в сворачивании самоассоциированной формы апоЕ. Этот конформационный переход происходит именно в самоассоциированной, а не в мономерной форме апоЕ из-за быстрой самоассоциации в исследованной области концентраций в физиологических условиях [6]. Обратимое снижение интенсивности флуоресценции флуоресцеинового хромофора при ренатурации апоЕ/Ф регистрировалось и в нашей предыдущей работе по денатурации/ренатурации апобелка, измеренных в равновесных условиях [6]. Можно полагать, что холодовая инкубация сопровождается накоплением 'открытого' конформера тетрамера апоЕ. Тепловая инкубация приводит к переходу 'открытого' конформера самоассоциированной формы апобелка в 'закрытый', т.е. схему поведения апоЕ в растворе, предложенную нами ранее [6], можно дополнить на основании равновесных измерений: олигомер (при старении препарата)  тетрамер 'закрытый'  тетрамер 'открытый'  нативный или частично денатурированный мономер  полностью денатурированный мономер.

Какова же природа сил, стабилизирующих надмолекулярную структуру апобелка при его самосборке в растворе? Отмеченная разница в температурной зависимости изменения интенсивности флуоресценции апоЕ/Ф указывает на вовлеченность гидрофобных взаимодействий. Известно, что гидрофобное 'сцепление', возникающее между алифатическими радикалами, более стабильно при комнатной температуре, чем при 0њС, из-за эндотермичности перехода от воды к неполярному растворителю для этих групп [19]. Именно этим объясняется факт холодовой денатурации многих белков [20]. Предположению о вовлеченности гидрофобных взаимодействий в процесс структурирования тетрамера апоЕ соответствуют данные о значительном снижении доступности флуоресцеинового хромофора для анионов I^- при инкубации апобелка при 24њС, по сравнению с отсутствием изменений доступности при инкубации при 0њС (см. таблицу). В то же время нельзя исключить и участия спаривания зарядов при самоассоциации апоЕ, так как 'сшивка' водорастворимым карбодиимидом приводила к образованию тетрамерной формы апоЕ (рис. 4). Увеличенным структурированием, т.е. большей плотностью упаковки белковой молекулы при 24њС, объясняется и снижение величины r при инкубации апоЕ/Ф при 24њС и отсутствие заметных изменений этого параметра за 6 часов инкубации при 0њ (см. таблицу). Отметим, что падение анизотропии флуоресценции вряд ли можно объяснить снижением интегральной интенсивности, так как снижение квантового выхода может сопровождаться лишь уменьшением времени жизни возбужденного состояния, что может приводить лишь к росту величины r. Структурирование тетрамерной формы апоЕ с образованием и конденсацией гидрофобного 'ядра', вместе с тем, не приводит к заметным изменениям расстояний между центрами 'светящихся сфер' - отдельных молекул апоЕ в тетрамерном ассоциате - так как величина E не изменялась при инкубации при обеих температурах (см. таблицу). Из этого также следует, что в изученном временном интервале не наблюдалось и значительной самоассоциации в более высокомолекулярные олигомерные формы апобелка. Открытым остается вопрос о достижении равновесной ситуации по разным флуоресцентным параметрам (см. таблицу). Если по результатам измерения r можно полагать, что достигается равновесие после 6 часов инкубации при 24њС, то интенсивность флуоресценции апоЕ/Ф продолжала падать. Требуется более детальное изучение кинетики изменения различных параметров.

Биологическая значимость обнаруженной надмолекулярной организации апоЕ в растворе может заключаться в контролировании встраивания молекул апобелка в липидную фазу липопротеидных частиц и клеточных мембран и контролировании степени агрегированности апобелка в липиде, что, в свою очередь, может определять эффективность взаимодействия апоЕ-содержащей липопротеидной частицы с В,Е- или Е-рецепторами. Выявленный в данном исследовании факт медленного сворачивания апоЕ после действия детергента поднимает вопрос о равновесном состоянии апобелка в апоЕ-фосфолипидных рекомбинантах, полученных при диализе из детергентного раствора. Эти структуры могут быть кинетически нестабильны, если сворачивание апобелка в липидной фазе напоминает его самоассоциацию в растворе. Конформационно неустойчивым может быть также апобелок после диссоциации от поверхности ЛОНП и хиломикронов при их липолизе, и взаимодействие липид-свободного апоЕ с сывороточным альбумином, показанное нами [23], может тогда стабилизировать структуру апоЕ в сыворотке.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований, грант 98-04-48060.

[На список литературы] [На оглавление] [На список сокращений и обозначений]