[На предыдущую главу]

Процесс самоассоциации молекул апоЕ в надмолекулярную структуру был изучен: 1) при обмене индивидуальными молекулами апобелка между предсуществующими в растворе самоассоциированными формами; 2) при ренатурации белка, предварительно денатурированного гуанидин-гидрохлоридом и детергентом холатом Nа. Основной подход, использованный в этих экспериментах, заключался в изучении индуктивно-резонансного переноса энергии между донор- и акцептор-меченными молекулами апоЕ. Спектральные характеристики дансил-меченного апобелка в качестве донора энергии и флуоресцеин-меченного апоЕ как акцептора представлены на рис. 1. Стехиометрия мечения для донорной молекулы составляла 4,1 молекулы метки/молекулу белка, для акцепторной - 5,1 молекулы метки/молекулу белка. Отметим значительное перекрывание полос флуоресценции донора и поглощения акцептора - необходимое условие протекания процесса. Радиус Ферстера для выбранной донор-акцепторной пары (расстояние, на котором скорость безызлучательного переноса равна сумме скоростей дезактивации возбужденного синглетного уровня) равен 33-41 Е [18]. Перенос энергии в растворе между апоЕ/Д и апоЕ/Ф изучали по сенсибилизированной флуоресценции акцептора при возбуждении в полосе поглощения донора. Из представленных на рис. 2 данных видно тушение флуоресценции донора при смешивании донорных и акцепторных молекул апобелка в мольном соотношении 1:3 и превышение интенсивности флуоресценции в полосе свечения флуоресцеина по сравнению с суммой независимо измеренных спектров флуоресценции донора и акцептора. В данном конкретном случае величина эффективности переноса энергии составляла 6,2%.

В следующей серии экспериментов была изучена самосборка апобелка в надмолекулярную структуру при диализе препаратов дансил- и флуоресцеин-меченного апоЕ, предварительно денатурированных в 4 М Gdn-НCl. При увеличении мольной доли акцептора от 0 до 0,75 величина Е возрастала от 0% до 29% (рис. 3). Отметим отклонение зависимости от линейной при большом содержании апоЕ/Ф. Аналогичные результаты были получены при изучении самоассоциации молекул апоЕ, предварительно солюбилизированных холатом натрия. Эффективность переноса энергии в этом случае была изучена как функция среднего содержания акцепторных флуоресцеиновых групп на индивидуальной молекуле апоЕ. При стехиометриях мечения, равных 1,9 и 4,9 моль флуоресцеина/моль апоЕ, величина Е составляла 29,2+2,6% (среднее+ошибка среднего в трех независимых экспериментах) и 54,2% соответственно (среднее в двух независимых экспериментах). В этих экспериментах мольное отношение дансил- и флуоресцеин-меченного апоЕ равнялось 1:1. Таким образом, двумя подходами продемонстрирована чувствительность величины Е к плотности распределения акцепторных групп вблизи светящейся донорной сферы.

Для подтверждения связи величины переноса энергии с самоассоциацией молекул апоЕ был использован независимый подход для визуализации белок-белковых контактов в той же зоне концентраций апобелка (0,5-0,8 мкМ). При изучении кинетической зависимости 'сшивания' препарата апоЕ водорастворимым бифункциональным реагентом ЭДК наблюдалось образование промежуточных димерных и тримерных форм, и конечного продукта - тетрамера апоЕ (рис. 4).

В следующей серии экспериментов была изучена кинетика процесса сворачивания апоЕ. Для этого измеряли изменения во времени различных флуоресцентных параметров - величины E, интенсивности и анизотропии флуоресценции апоЕ/Ф, параметров тушения флуоресцеиновых хромофоров - при инкубации апобелка при 0њС (холодовая инкубация) или 24њС (тепловая инкубация) после диализа преденатурированных препаратов апобелка. Для оценки вклада гидрофобных взаимодействий в процесс сворачивания белка можно сравнить температурные зависимости конформационно-чувствительных параметров [19,20]. Использовали как алкил-апоЕ, так и препарат с восстановленными дитиотреитолом SH-группами без специального анализа возможных различий в кинетических ответах этих двух препаратов. Стехиометрия мечения дансилом и флуоресцеином в трех процедурах мечения составляла соответственно 4,1-12 и 3,6-4,9 молекул метки/молекулу белка. При мономеризации апоЕ холатом Na эффективность переноса энергии E случайным образом флуктуировала вблизи величины 29% в процессе 6-часовой инкубации апобелка как при 0њС, так и при 24њС (см. таблицу). Не менялась также величина анизотропии флуоресценции при холодовой инкубации, а при тепловой инкубации наблюдалось статистически значимое снижение этого параметра с 0,146 до 0,135 (см. таблицу). Таким образом, инкубация после диализа выявляет, по наличию переноса энергии и высокому значению анизотропии, самоассоциированную форму апобелка.

Снижение в среднем на 4% интенсивности флуоресценции флуоресцеинового хромофора при инкубации апоЕ/Ф при 24њС было выражено существенно меньше по сравнению с изменением интенсивности флуоресценции (в среднем на 16%) при инкубации при 0њС (см. таблицу). Квантовый выход флуоресценции дансил-меченного препарата апобелка также падал в процессе 6-часовой инкубации в среднем на 13-17%, однако не было выявлено статистически значимого влияния температуры на этот параметр (данные не приведены). Для подтверждения конформационных изменений при самосборке после детергент-индуцированной денатурации было исследовано тушение анионами I^- флуоресценции апоЕ/Ф. При обеих температурах инкубации процесс тушения характеризовался гетерогенностью. Степень доступности хромофоров (в среднем 0,79) не изменялась после 6-часовой холодовой инкубации и статистически значимо снижалась в среднем до 0,45 при тепловой инкубации (см. таблицу). Константа тушения Штерн-Фольмера хромофоров, остающихся доступными для тушения, не изменялась в процессе инкубации при обеих температурах (см. таблицу). Подчеркнем, что величины E, r, квантовых выходов апоЕ/Ф и апоЕ/Д и параметры тушения флуоресценции апоЕ/Ф изменялись аналогичным образом при ренатурации апобелка, преденатурированного Gdn-HCl (данные не приведены). Можно предположить наличие конформационных изменений, например, за счет сворачивания, приводящих к снижению доступности хромофоров для водной фазы, т.е. при образовании тетрамера эта форма флуктуирует к более структурированному состоянию апоЕ с образованием гидрофобного 'ядра', экранированного от водной фазы, из самоассоциированного, но 'открытого' для молекул воды состояния.

[На следующую главу] [На оглавление] [На список сокращений и обозначений]

Copyright ї