Микроинъекция тубулина
Ампулы с расфасованном тубулином хранятся в азотном хранилище. В каждой
ампуле примерно 10 ml тубулина в концентрации 10 mg/ml.
1. Достать ампулу, положить на стол. Подождать, пока она оттает.
2. Развести содержимое ампулы PM буфером в 1,5 раза
(+ 5 ml PM буффера)
3. Центрифугировать 10-20 мин на максимальных оборотах (200 000 g) при
температуре +4°С, далее в течение всего времени эксперимента хранить ампулу
при +4°С (на льду).
4. Отобрать надосадок микрошприцом
5. Перед каждым внесением тубулина в микроиглу протереть иглу микрошприца
фильтровальной бумагой
6. Внести 1 ml тубулина в микроиглу
7. Наколоть не меньше 50 клеток
8. Убедиться, что тубулин светиться внутри клеток
9. Поставить чашку с клетками в термостат на 30 мин
10. Добавить оксиразу (2-3 % по объему, 90 ml на 3 ml среды)
11. Добавить молочную кислоту (лактат, 3 ml на 3 ml среды)
12. Наслоить минеральное масло на среду (~ 3 мл)
Экспозиция не должна превышать 1 секунду (лучше 0,3-0,4 сек)
Интервал между кадрами 3 секунды
201 кадр составит 10 минут
|