Структурные перестройки каталитического субдомена эндонуклеаз рестрикции II типа: проверка гипотезы Я.Буйницкого

' Working horses of molecular biology '

Эндонуклеазы рестрикции II типа (ЭР II)

Благодаря высокой специфичности взаимодействия с ДНК, эти ферменты используются для:

• картирования ДНК;
• хромосомного анализа;
• конструирования новых ДНК;
• в составе моделей для решения вопроса о природе специфического ДНК-белкового узнавания.

Эндонуклеазы рестрикции II типа являются компонентами прокариотических систем рестрикции-модификации:

Структурные и функциональные различия обеспечили разделение ферментов данного типа на 2 группы:

EcoRI-подобные ( α-класс )	ферменты, которые связываются с ДНК со стороны большой бороздки; узнают специфические основания ДНК посредством α-спирали и петли (так называемый α-класс ЭР II); гидролизуют ДНК с образованием 5'- "липких" концов;
EcoRV-подобные ( β-класс )	ферменты, которые связываются с ДНК со стороны малой бороздки; для распознавания специфических участков ДНК используется β-тяж и β-поворот (так называемый β-класс ЭР II); гидролиз ДНК идет с образованием "тупых" концов.

... А что известно об эволюционный связи этих белков ?..

За малым исключением нескольких близкородственных изошизомеров (ферментов, узнающих и гидролизующих одинаковые последовательности), очевидного сходства последовательностей среди эндонуклеаз рестрикции II типа не обнаруживается. Первоначально из этого было сделано неверное заключение, что большинство эндонуклеаз не связаны эволюционно. Однако результаты дальнейших исследований показали, что ЭР II не возникали независимо и произошли от одного или нескольких предшественников. Одним из наиболее убедительных подтверждений этому стали результаты кристаллографического анализа.

Сравнивать структуры ЭР II непросто, ведь геометрия их достаточно сложна. Рисунок 1 демонстрирует лучшее совмещение двух структур, которое можно получить:

Рис.1. Совмещение структур MunI (EcoRI-like) и MspI (EcoRV-like).

Мы провели сравнение 14 структур рассматриваемых ферментов. Такое сопоставление выявило наличие общего мотива α β β β, лежащего в основе структурного ядра:

Рис.2. Общий для рассматриваемых эндонуклеаз мотив α β β β.

В работах профессора Януша Буйницкого (Janusz M. Bujnicki, [ 1 ], [ 2 ] ) предложена гипотеза о возможной эволюции эндонуклеаз II типа на основании некоторого сходства трехмерных структур. Им предложена следующая модель событий, связанная с множественностью перестройки структуры: важнейшее значение в ходе эволюции имела дивергенция периферических элементов структур. Возможные структурные перестройки (круг - α-спираль; треугольник - β-стренд (стандартные обозначения TOP-CARTOONS)), произошедшие в ходе эволюции, представлены в виде схемы:

Согласно этой гипотезе, существовал некий общий предок, от которого взяли начало представители 2х классов эндонуклеаз рестрикции 2 типа: RI- и RV - подобных.

[ 1 ] - J.M. Bujnicki (2001) Understanding the evolution of restriction - modification systems: Clues from sequence and structure comparisons. Acta Biochimica Polinica, V. 48. N4. P. 935-967.

[ 2 ] - J.M. Bujnicki (2003) Crystallographic and Bioinformatic Studies on Restriction Endonucleases: Inference of Evolutionary Relationships in the 'Midnight Zone' of Homology. Current Protein and Peptide Science, 2003, 4, 327-337.

Однако, в предложенной последовательности эволюционных событий имеются существенные перестройки структур белков. Перестройки затрагивают как ДНК-узнающий и димеризационный субдомены, так и каталитический субдомен.

Целью нашей работы стал анализ возможных структурных перестроек на разных этапах эволюции эндонуклеаз рестрикции в соответствии с предложенной Я.Буйницким схемой.

Мы предположили, что на каждой стадии эволюции неизменными оставались:

1. стабильность структуры каталитического субдомена;
2. целостность активного сайта.

• существование так называемого "верхнего" слоя (на рис.3 элементы, входящие в его состав, выделены зеленым);
• особым искривлением центрального β - листа (на рис.3 выделен желтым).

Рис.3. Структурное совмещение ядер каталитических субдоменов.

Для решения поставленной задачи была составлена выборка из 15 структур (с максимально хорошим разрешением), включающая представителей обоих классов: EcoRI- и EcoRV-подобных:

Для анализа и сравнения структур, описания топологии элементов вторичной структуры, формирующих ядро каталитического субдомена, была предложена такая ортогональная система координат:

• за начало отсчета принимается 2ой каталитический аминокислотный остаток (как правило, это аспарагиновая либо глутаминовая кислота; принадлежит второму β-стренду мотива αβββ);
• β-тяж, содержащий 2ой аминокислотный остаток, нумеруется как β 12. Номера для остальных рассматриваемых элементов вторичной структуры присваиваются относительно числа 12, в зависимости от возрастания/убывания порядкового номера входящих в состав аминокислот;
• направление осей ОХ, ОУ, ОZ показано на схеме.

Топологические карты позволяют эффективно сравнивать расположение элементов вторичной структуры, формирующих ядро каталитического субдомена. Это наглядный и вполне удачный способ визуализации результатов.
Итак, топологические карты содержат элементы вторичной структуры, располагающиеся в 4,5 - ангстремной окрестности консервативного мотива. Правила обозначения элементов топологических карт:

• S либо H - обозначения для тяжей и спиралей соответственно;
• тяжи, формирующие центральный β-лист, соединены жирными линиями;
• круги и прямоугольники отражают ориентацию элементов вторичной структуры: круги соответствуют "параллельной" ориентации (т.е. направление противоположно тяжу 2 мотива αβββ); прямоугольники - для указания на "антипараллельную" ориентацию (направление как у тяжа 2).

Указанные карты были составлены для всех рассматриваемых структур ЭР. Результатом их сравнения стало составление единых карт для двух классов эндонуклеаз рестрикции II:

Рис.4. Обобщенные топологические карты для представителей ЭР II обоих классов.

При сравнении полученных топологических схем выявилось следующее:

• характеристический мотив αβββ - часть структурного ядра каталитического субдомена;
• число тяжей в центральном листе может варьировать (хотя в рассматриваемых структурах их не менее 5); ориентация 5-го тяжа различна для представителей двух классов;
• обеспечивающий стабильность ядра "верхний" слой включает не менее двух элементов;
• очевидно, "нижний" слой служит для взаимодействия с ДНК, его структура вариабельна.

Возможно ли существование предполагаемой предковой формы?

Общей предковой формой считается белок, структура которого образована β-листом из 4х ориентированных определенным образом тяжей, одной α-спиралью над β-листом и еще одной - под β-листом.
При составлении топологических карт, структуры, соответствующей гипотетическому общему предку ЭР обоих классов выявлено не было. Наиболее близкой по топологии к гипотетической предковой форме является структура PvuII (см.рис.5).

(a) (b)
Рис.5. Топология элементов вторичной структуры гипотетического предшественника (схема Я. Буйницкого, (a)) и топологическая карта структуры PvuII (b).
Мы предположили, что наличие сплошного верхнего слоя (наблюдаемого во всех проанализированных структурах) является обязательным условием стабильности каталитического субдомена.
Поэтому для объяснения стабильности предполагаемого предка приходится предположить еще более крутой изгиб основного β-листа для того, чтобы крайний 4-й тяж контактировал с α-спиралью (в данном случае, стабильность каталитического ядра может быть достигнута только таким образом). Указанный крутой изгиб не наблюдается в существующих структурах.

По Буйницкому, от гипотетического общего предка (для обоснования существования которого, все же, требуются дополнительные аргументы) предполагается фактически единовременное возникновение 2-х классов ЭР - EcoRI-подобные и EcoRV-подобные. К такому разделению привело появление в составе листа пятого β-тяжа, разнонаправленного y представителей указанных классов.

Мы постадийно, используя предложенные топологические карты, проанализировали и обозначили события, которые могли бы привести к образованию ферментов именно с такой топологией.

Наиболее интересные случаи перестроек элементов вторичной структуры в составе ядра каталитического субдомена...

...представлены ниже:

	EcoRV : потеря 6-го тяжа центрального β листа (существенного влияния на стабильность структуры не оказывается);
	NaeI: добавление нового элемента в "верхнем" слое - по-видимому, эта α-спираль влияет на структурную стабильность ядра;
	BglII: наблюдается замещение С-концевой α-спирали на новую N-концевую спираль (также входит в состав "верхнего" слоя). Но, по-видимому, в данном случае речь не идет о циклической перестановке (хотя бы потому что указанные α-спирали разнонаправлены);
	BsoBI: вставка 3-х дополнительных тяжей между консервативными элементами αβββ-мотива. Однако, их влияние на устойчивость структурного ядра каталитического субдомена несущественно.

Наконец, "нестандартным" событием в ходе эволюции стало появление ЭР II, обладающих так называемым "неклассическим" типом активного сайта.
Как известно, в ЭР II 3 заряженных аминокислотных остатка пространственно сближены в ядре. Они могут располагаться в 2-х тяжах, формирующих мотив αβββ (в таких случаях активный сайт называется "классическим"). Либо один из каталитических аминокислотных остатков (Glu, как правило) может находиться в негомологичной спирали, следующей сразу после консервативного αβββ-мотива.

Рис.6. Структурное совмещение ядер каталитических субдоменов, демонстрирующих "классический" (MunI) и "неклассический"(NgoMIV) тип активных сайтов.

Я.Буйницкий предполагает, что возникновение ферментов с активным центром "неклассического" типа (все структуры таких ЭР принадлежат подклассу IIF) шло из предковых эндонуклеаз. Мы не исключаем, что развитие эволюционных событий могло быть следующим: в результате точечных мутаций у общего предка близких структур (см. схему; EcoRI и Cfr10I, например) в нижней альфа-спирали появился аминокислотный остаток, способный выполнять роль одной из трех аминокислот активного центра "классического" типа, а именно второй по последовательности (эта аминокислота принадлежит третьему тяжу).

Выводы:

• существование гипотетического предка не обоснованно и нуждается в дополнительной аргументации;
• стабильность структурного ядра каталитического субдомена обеспечивается особым искривлением центрального β-листа и наличием так называемого "верхнего" слоя;
• Следующие глобальные перестройки могли бы произойти в соответствии с предложенной схемой:
  • появление новых N- , С-концевых элементов;
  • замещение N-концевого элемента на С-концевой, выполняющий сходную функцию;
  • вставка новых дополнительных элементов в консервативный мотив;
  • пространственная "миграция" аминокислотных остатков каталитической триады.