Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://plantphys.bio.msu.ru/education/growth.doc Дата изменения: Tue Jun 7 16:07:11 2011 Дата индексирования: Mon Oct 1 19:31:44 2012 Кодировка: koi8-r

Задача 1.
. Биотест для определения биологической активности веществ ауксиновой
природы.

Биотест (биопроба) - это метод обнаружения и определения активности
гормонов и фенольных ингибиторов по реакции целых растений, их органов,
тканей и клеток, обладающих повышенной специфической чувствительностью к
этим соединениям. Биотесты используют для 1) качественного обнаружения
фитогормона в смесях неизвестных веществ; 2) оценки количества гормона
или фенольного ингибитора в исследуемой смеси; 3) обнаружения (или
изучения) физиологических процессов, в которых участвуют физиологически
активные вещества; 4) анализа свойств новых синтетических регуляторов
роста.

Объекты, используемые для биотеста должны удовлетворять следующим
требованиям: 1) стандартность исходного материала и его ответных реакций;
2) легкая воспроизводимость результатов; 3) высокая чувствительность к
данному веществу. Тест-объект должен реагировать на маленькие
концентрации исследуемого вещества, а это возможно при низкой исходной
концентрации вещества в клетках; 4) специфичность (ответные реакции
только на определенную группу физиологически активных веществ).

По характеру физиологических реакций, вызываемых гормонами, биотесты
делят на группы: ростовые, пигментные и ферментные. Ростовые: изгибание и
удлинение отрезков стеблей или колеоптилей у злаков, рост каллуса,
прорастание семян. Пигментные: синтез хлорофилла (зеленение листьев),
накопление каротиноидов. Ферментные: гормоны могут стимулировать синтез
ферментов, например ?-амилазы. [1]

Ауксины - гормоны, вырабатываемые в апикальных меристемах побегов.
Наиболее чувствительны к ауксинам корни, затем почки и, наконец, стебли
растений. Установлено, что низкие концентрации ускоряют, а высокие
тормозят рост этих частей растений. Ауксины влияют на рост в фазе
растяжения, тропизмы, дифференцировку ксилемы и закладку корней,
апикальное доминирование, опадание листьев, цветение, рост пыльцевых
трубок, завязывание и рост плодов, образование клубней и луковиц,
прорастание семян. [2]

Кроме природных ауксинов химикам удалось синтезировать вещества,
вызывающие такой же физиологический эффект. Поскольку они не встречаются
в растениях, их называют синтетическими аналогами ауксинов. Среди них
упомянем лишь 2,4-Дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) и (-
нафтилуксусную кислоту (НУК). Синтетические аналоги эффективно
связываются с рецепторами ауксина, однако слабо взаимодействуют с
системой транспорта или окислительной деградации естественных ауксинов.
[pic]
. Цель задачи: изучить влияние ауксинов на прорастание семян капусты.

. Объект исследования:

. Реактивы и оборудование. Стерильные колбы с агаризованной средой
Мурасиге и Скуга (МS) 300 мл, 70%-ый раствор этилового спирта;
диметилсульфоксид (DMSO), раствор ?-индолилуксусной
кислоты (ИУК) (4мг в 1000мкл DMSO), 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты
(2,4-D) (5мг в 1500мкл DMSO) либо ?-нафтилуксусной кислоты (НУК) (3мг в
1500мкл DMSO); стерильный раствор 5% Н2О2 на 960 этиловом спирте;
автоматические пипетки (5-40мкл и 40-200 мкл) и стерильные
наконечники, стерильные пробирки Эппендорф (объемом 1,5 мл), стерильные
стаканчики на 50 мл, стерильные чашки Петри (5 шт. диаметром 9 см и 1шт.
диаметром 6см), стерильные фильтры, ножницы, пинцеты, парафилм или
пленка.



. Ход работы:
1. Плавят на водяной бане агаризованную среду.
2. Подготавливают ламинар-бокс к работе: включают продувку воздуха ламинар-
бокса на 5 мин, протирают всю внутреннюю поверхность ламинар-бокса 70%
спиртом. После этого приступают к работе. Продувка ламинара продолжается
в течение всей работы.
3. Рассчитывают величину вносимого в среду объема гормона для каждого
варианта концентрации (на 50мл среды).
| |Концентрация гормона | контроль|0,002|0,02 |0,2 |2 |
| |[мг/л] |0 | | | | |
|ИУК / 2.4D |вносимый V исходного р-ра | | | | | |
|/ НУК |[мкл] | | | | | |
| |вносимый V разведенного р-ра | | | | | |
| |[мкл] | | | | | |
| DMSO | V | | | | | |
| |[мкл] | | | | | |


4. Перед работой моют руки и протирают их спиртом.
5. Все последующие процедуры проводят в стерильных условиях в ламинаре.
(Закрывание/открывание эппендорфов, открывание стаканчиков с помощью
предварительно обожженного над горелкой пинцета и т.д.).
6. (Если необходимо, готовят исходный раствор фитогормона нужной
концентрации.)
7. Отливают 50 мл среды в стаканчик. Пробку с колбы снимают в стерильных
условиях. Перед тем как отлить питательную среду, горло колбы обжигают
над горелкой.
8. Добавляют концентрированный раствор гормонов в необходимом объеме (для
получения следующих концентраций фитогормона в среде: 0,002 мг/л, 0,02
мг/л, 0,2 мг/л или 2 мг/л) в стаканчик со средой, контроль не содержит
гормона.
9. Добавляют необходимый объем растворителя (DMSO). Перемешивают среду.
10. Переливают среду в чашку Петри в стерильных условиях (перед тем как
перелить питательную среду, горло стакана обжигают над горелкой),
накрывают крышкой.
11. Оставляют среду застывать при комнатной температуре.
12. Повторяют все для каждой концентрации гормона (с 5 по 8 пункты).
13. Стерилизуют растительный материал по схеме:
Заранее готовят стерильный раствор 5% Н2О2 на 960 этиловом спирте и
хранят в темноте.
Семена раскладывают в один слой в 6см чашку Петри на стерильный бумажный
фильтр и с помощью пипетки наносят раствор по капле на 3 минуты (пока не
испарится спирт).
14. Семена сажают в 9см чашку Петри пинцетом, по 25-30 семян (семена можно
не промывать после стерилизации).
15. Герметизируют чашки Петри парафилмом или пленкой. Дальнейшую работу
можно проводить в нестерильных условиях.
16. Надписывают чашки Петри (указывают группу, число посадки, название и
концентрацию гормона).
17. Чашки помещают на 16-ти часовой световой день и t=+200С.


18. Через две недели визуально оценивают различия проростков в чашках с
различной концентрацией гормона, если есть фиксируют нарушения
геотропизма, проводят измерения гипокотиля и корня каждого выросшего
растения, отмечают, если произошло заражение.
Полученные результаты заносят в таблицу, проводят статистический анализ
(подсчет средних значений и стандартных отклонений для оценки
достоверности полученных результатов), строят графики зависимости длины
гипокотиля/корня от концентрации в среде ИУК/2,4D/НУК. Объясняют
результаты.


ЛИТЕРАТУРА к зачету:
Полевой В.В. «Физиология растений»: Учеб. для вузов. М.: "Высш.
шк.", 1989.
Бутенко Р.Г Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии
на их основе. М., ФБК-ПРЕСС, 1999.
Медведев «Физиология растений»
Бутенко Р.Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре
клеток растений // 35-е Тимирязевское чтение. М., 1985.
Гудвин Т., Месер С. Введение в биохимию растений. Т 1,2. М., Мир, 1986.
Гэлстон К., Девис П., Сэттер Р. Жизнь зеленого растения. М., 1983.
Дерфлинг К. Гормоны растений. М., 1985
Кулаева О.Н. Гормональная регуляция физиологических процессов у растений на
уровне синтеза РНК и белка// 41-е Тимирязевское чтение. М., 1982.
Полевой В.В. Фитогормоны. Л., 1982.
Полевой В.В. Роль ауксина в системах регуляции растений // 44-е
Тимирязевское чтение. Л., 1986
Уоринг Ф., Филлипс И. Рост растений и дифференцировка. М., 1984.