Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://kodomo.fbb.msu.ru/FBB/year_02/science_1/Krajnov.doc Дата изменения: Fri Nov 14 15:47:42 2003 Дата индексирования: Tue Oct 2 10:46:02 2012 Кодировка: koi8-r

Построение трехмерной модели амидазы R.rhodochrous.





































Работу выполнил А.Крайнов
Руководитель Г.Чилов




Общая харектеристика амидаз
Ациламид-фмидогидролазы (амидазы) относятся к классу
ферментов, катализизирующих гидролиз амидов карбоновых кислот до
свободных кослот и аммиака:
R-CONH(2)+H(2)O==R-COOH+NH(3)
Амидогидролазы вовлечены в азотистый обмен в организме и
широко распространены в природе: они обнаружены как в про- так и
в эукариотах. Эти ферменты часто встречаются у бактерий,
относящихся к группе нокардио подобных актиномицетов (нокардий,
родококков, артробактерий). К настоящему времени выделены и
охарактеризованы амидазы из различных источников, существенно
различающихся по спицефичности.Одни из них преимущественно
гидролизуют амиды алифатических кислот(R. rhodochrous), другие -
ароматических , третьи расщепляют амиды A- или W-аминокислот,
некоторые амидазы стереоселективны. Несмотря на большое число
публикаций, данных о пространственной организации белков пока
нет. В связи с этим систематический сравнительный анализ
структурно-функциональной организации амидаз практически не
проводился.Среди бактериальных ферментов этого типа наиболее
детально изучены амидазы из Brevibacterium sp. ,Rhodococcus
rhodochrous и Pseudomonas aeruginosa. Нативные состоят из
нескольких идентичных субъединиц и относятся, по всей видимости,
к классу сульфгидроильных ферментов. Они проявляют два типа
активности - амидо-гидролитическую(1) и амидотрансферазную(2):
R-CONH(2)+H(2)O==R-COOH+NH(3) (1)
R-CONH(2)+NH(2)OH==R-CONHOH=NH(3) (2)
Многие микроорганизмы используют нитриллы органических кислот
как источники азота и углерода.
Субъединичный состав. Практически все изученные амидазы
обладают четвертичной структурой и состоят из четного числа
одинаковых субъединиц, однако размер субединиц и их количество
изменяютсся в достаточно широком диапозоне. У Rhodococcus
rhodochrous 4 субъединицы массой 42 кДа, подобные размеры имеет
амидаза "широкого спектра действия" из Brevibacterium sp. (4*43
кДа).
рН-оптимум активности. Установлено, что амидаза
высокоактивна в достаточно широком диапозоне рН - от 5 до 8. За
пределами этих значений рН наблюдается резкое снижение
активности. Так про рН около 3,7 и 8,5 фермент проявляет лишь
50% своей активности.
Температурный оптимум действия амидазы лежит в диапозоне
55-60 С. При 37 С фермент проявляет лишь 37% максимальной
активности. Ометим, что несмотря на различный субъединичный
состав и специфичность, практически все амидазы
наиболее активны при достаточно высоких температурах - около 55
С. Исключение составляет пептид-амидаза из Stenotrophomonas
maltrophila, обладающая максимумом активности при 39-45 С.
Аминокислотный состав. Амидаза показывает некоторое
превышение содержания кислых остатков над основными(табл. 1).
Подобное соотношение характерно и для амидазы из P. aeruginosa,
содержащей в ~1,5 раза больше кислых остатков. Содержание
гидрофобных остатков, формирующих ядро белков, также сходно.








Табл.1 аминокислотный состав R.rhodochrous и P.aeruginosa

|Аминокислота |R.rhodochrous |P.aeruginosa |
|Cys |8 |9 |
|Met |14 |15 |
|Asp |32 |34 |
|Thr |21 |13 |
|Ser |15 |16 |
|Glu |26 |41 |
|Pro |20 |17 |
|Gly |31 |34 |
|Ala |34 |32 |
|Val |22 |23 |
|Ile |21 |21 |
|Leu |22 |20 |
|Tyr |15 |17 |
|Phe |12 |9 |
|Trp |10 |6 |
|His |11 |7 |
|Lys |18 |15 |
|Arg |17 |19 |
|Всего |349 |346 |

Субстратная специфичность. Лучшими субстратами для амидазы
из R. rhodochrous являются амиды алифатических органических
кислот - ацетамид и пропионамид(табл.2). Наличие двойной связи
по соседству с гидролизуемой группой, приводящее к изменению
конформации субстрата, существенно снижает активность фермента
(степень гидролиза акриламиде 75%), а введение метильного
радикала в окружение а-углеродного атома в случае метакриламида
уменьшает гидролиз на порядок (до 6,7%). Фермент с низкой
скоростью гидролизует объемные ароматические амиды и не обладает
уреазной активностью. Амидаза R.

Табл.2 Специфичность амидазы R.rhodochrous

|субстрат |Активность% |
|Мочевина |0 |
|Ацетамид |100,0 |
|Акриламид |75,0 |
|Метакриламид |6,7 |
|Пропионамид |92,0 |
|Хлорацетамид |12,1 |
|Никотинамид |2,5 |
|Бензамид |4,5 |



rhodochrous совершенно не расщепляет амиды альфа-аминокислот. Не
гидролизуются также и w-амиды a-аминокислот. Даже небольшой по
объему амид аминоуксусной кислоты не является субстратом для
данного фермента. Очевидно. наличие протонированной в рабочем
диапозоне рН(~7,5) NH(2) группы у а-углеродного атома
препятствует связыванию субстрата ферментом и/или осуществлению
каталитического цикла.
Влиянте ионов металлов и ингибиторов на активность
амидазы. Фермент полностью ингибируется ионами тяжелыхметаллов -
характерными реагентами на сульгидрильную группу(табл.3). Кроме
того его активность полностью подавяется в присутствии ионов
Fe(3+). Комплексоны - ЭДТА и о-фенантролин не влияют на
активность; очевидно, данный фермент не является
металлозависимым. Ингибиторы сериновых протеиназ (PMSF и DIFP)
также не ингибируют фермент. В то же время в присутствии DTT
активность фермента увеличивается в ~1,5 раза. Эти данные
свидетельствуют о важной роли сулььфгидрильной группы в
механизме действия фермента.

Табл.3 влияние металлов и ингибиторов на активность амидазы

|Реагент |Остаточная |Реагент |Остаточная |
| |активность | |активность |
|FeCl(3) |0 |DTT |145,0 |
|ZnSO(4) |27,5 |PMSF |101,0 |
|CuSO(4) |0 |фенантролин |119,5 |
|AgNO(3) |0 |ЭДТА |126,3 |


Экспериментальная часть
Последовательности амдазы из P.aeruginosa(1k17) и NitFhit
из С.elegans(1ems) были взяты из базы данных
http\\srs.ebi.ac.uk\ в ent и FASTA формате. На сервере института
Белозерского было сделано выравнивание с помощью программы
AliBee. По результатам выравнивания - процент гомологии с
амидазой из P.aeruginosa - 85,2 %(c NitFhit из C.elegans~30%).
Построение трехмерной модели амидазы R.rhodochrous производилось
на сервере http\\expasy.org\ с использованием амидазы из
P.aeruginosa как темплата и NitFhit из C.elegans для
дополнительной проверки. В результате запроса был поучен файл с
3-D моделями трех белками(result.pdb). Трехмерная модель амидазы
из R.rhodochrous была сохранена в отдельном файле(m8-ami.pdb).


Результаты и их обсуждение.

Была получена трехмерная модель части амидазы из
R.rhodochrous. Используя программу SPDBV было посчитано
среднеквадратичное отклонение от амидазы из P.aeruginosa,
которое составило 0,10 А . В активним центре обоих ферментов
находятся одинаковые аминокислотные остатки Cys166, Glu59,

Рис.1 Каталитическая триада амидазы R.rhodochrous

[pic]

Lys127 (рис.1,рис.2),составляющие каталитическую триаду, и
Tyr192, Gln190, Cys166, отвечающие за

Рис.2 Каталитическая триада амидазы из P.aeruginosa

[pic]

связывание с субстратом(рис.3). Этим объясняется сходство
субстратной специфичности амидаз R.rhodochrous и P.aeruginosa
(амиды алифатических кислот). В NitFhit из C.elegans
выравнивание производилось по нитрилазному домену,
каталитическую триаду которого составляют Cys169, Glu54 и
Lys127.



Рис.3 Аминокислотные остатки, отвечающие за связывание с
субстратом
[pic]

Выводы.

1)С помощью программы Swiss-Model была построена третичная
структура амидазы из R.rhodochrous, исходя из его первичной
структуры и структур амидазы из P.aeruginosa и NitFhit из
C.elegans.

2)Среднеквадратичное отклонение от известной структуры из
P.aeruginosa составило 0,10 А для С-альфа атомов.

3)Структуры всех трех белков схожи, хотя процент гомологии с
NitFhit из C.elegans всего около 30%.

4)На основании полученной структуры было показано, что в
активных центрах амдаз из R.rhodochrous и P.aeruginosa находятся
одинаковые аминокислотные остатки Cys166, Glu59, Lys134, Gln190,
Tyr192, чем обясняется одинаковая субстратная специфичность.

Используемая литература
1)Биохимия(1999) т.64 Вып.4 с. 459-465.
2)Biochem.J.(2002)365,731-738
3)http\genomebiology.com\2001\2\1\reviews\0001.1
4)http\\brenda.uni-koeln.de\
5)http\\rcsb.org.