Л. О. Минушкина, Д. А. Затейщиков, О. Ю. Кудряшова, Д. А. Чистяков, В. В. Носиков, Т. Е. Цимбалова, В. Г. Баринов, Е. М. Носенко, В. П. Седов, Б. А. Сидоренко

Медицинский центр Управления делами Президента Российской Федерации и Государственный научный центр Российской Федерации "ГосНИИ генетика", Москва

Ключевые слова: дисфункция эндотелия; полиморфизм гена рецептора (тип 1) ангиотензина II; ишемическая болезнь сердца.

В последнее время значительное количество исследований посвящено поиску наследственных факторов, предрасполагающих к неблагоприятному течению основных сердечно-сосудистых заболеваний. Одно из основных направлений в этих исследованиях - изучение так называемых генов-кандидатов [1]. Если продукт экспрессии гена (фермент, гормон, рецептор, структурный или транспортный белок) может прямо или косвенно участвовать в развитии изучаемой болезни, то этот ген принято называть "геном-кандидатом". Сегодня использование полиморфных маркеров, расположенных внутри или рядом с различными генами-кандидатами, является основным подходом в изучении генетической предрасположенности к неблагоприятному течению сердечно-сосудистых заболеваний. Среди большого числа генов-кандидатов привлекает внимание ген рецептора (тип 1) ангиотензина II (AT2R1). Из описанных четырех типов рецепторов к ангиотензину II наиболее изучен именно этот тип рецептора. Через него реализуется не только констрикторное действие ангиотензина II, но и экспрессия факторов роста и пролиферация гладкой мускулатуры. Описаны различные аллели этого гена, кодирующие различающиеся по аминокислотной последовательности аллельные варианты этого рецептора [2]. Предполагается, что разные аллельные варианты рецептора могут приводить к различиям в эффективности связывания ангиотензина II и вследствие этого к определенным различиям в функционировании сосудистой стенки [3]. По современным представлениям, дисфункция эндотелия играет значимую роль в патогенезе артериальной гипертонии, атеросклероза и его осложнений.

Целью настоящей работы явилось изучение связи полиморфизма гена AT2R1 с дисфункцией эндотелия у больных ИБС.

Материал и методы

В исследование включены 73 больных ИБС (42 мужчины и 31 женщина), поступивших в стационар по поводу нестабильной стенокардии. Средний возраст больных составил 61,3 1,02 года, артериальной гипертонией страдали 64 пациента, курили 30, у 28 в анамнезе был крупноочаговый инфаркт миокарда. Более двух родственников первой степени родства, страдавших артериальной гипертонией либо ИБС или перенесших инсульт, было у 26 пациентов. Индекс Кетле составил в среднем 26,7 0,47 и был более 25,0 у 49 пациентов. Уровень общего холестерина в среднем равнялся 5,50 0,14 ммоль/л, у 28 больных он превышал 5,2 ммоль/л. Больные обследовались сразу после клинической стабилизации, на 3-7-й день после отмены гепарина. К этому моменту они не получали антикоагулянтной и антиагрегантной терапии, за исключением аспирина, который назначался всем пациентам, не имеющим противопоказаний. Не включались в исследование больные с острым инфарктом миокарда, острым нарушением мозгового кровообращения, сахарным диабетом 1-го и 2-го типов, среднетяжелого и тяжелого течения, системными заболеваниями, заболеваниями, требующими гормональной терапии, острыми инфекционными заболеваниями, нарушениями функции печени, получавшие терапию непрямыми антикоагулянтами, с постоянной формой мерцательной аритмии, застойной сердечной недостаточностью III и IV функциональных классов по NYHA.

В качестве базисного популяционного контроля использовали случайную выборку (n=100) неродственных пациентов травматологических отделений Москвы (без ИБС, артериальной гипертензии и сахарного диабета).

Гемостазиологическую функцию эндотелия оценивали путем измерения ингибитора тканевого активатора плазминогена, динамики протеина C и фактора Виллебранда при венозной окклюзии [4]. Измеряли также уровни D-димера, фибриногена, антитромбина III, плазминогена и антиплазмина. Измерение проводили на автоматическом анализаторе "Behring Coagulation Timer".

Сосудодвигательную функцию эндотелия оценивали на ультразвуковом аппарате SONOS 2500 (фирма "Hewlett Packard", США) линейным датчиком 5,5- 7,5 МГц по методике, описанной D. Celermajer и соавт. [5]. Плечевую артерию визуализировали в продольном сечении на 2-3 см дистальнее локтевого сгиба, диаметр артерии измеряли в диастолу. Диаметр оценивался в покое (после 10-15 мин отдыха). Стимулом, вызывающим зависимую от эндотелия дилатацию периферических артерий, была реактивная гиперемия, создаваемая манжетой, наложенной проксимальнее места измерения. На 3 мин создавалось давление, которое было на 40-50 мм рт.ст. выше систолического АД. Диаметр и скорость кровотока оценивались сразу после снятия манжеты, затем через 60 с. После восстановления диаметра артерии больной получал 0,5 мг нитроглицерина сублингвально. Измерение повторяли через 2 мин. Реакцию на усиление кровотока рассчитывали как разницу диаметров на фоне реактивной гиперемии и исходного, реакцию на нитроглицерин - как разницу диаметра на 2-й минуте после приема нитроглицерина и исходного.

Точность измерений прибора в нашем случае составляла 0,01 мм, воспроизводимость измерения диаметра артерии при использовании данной методики - 1-3% [6]. Нормальной реакцией плечевой артерии условно принято считать ее расширение на фоне реактивной гиперемии на 10% и более от исходного диаметра. Меньшая степень вазодилатации или вазоконстрикция считается патологической реакцией. Под дисфункцией эндотелия также понимается такое его состояние, при котором расширение сосуда в ответ на реактивную гиперемию достоверно меньше, чем на прием нитратов.

Для определения аллелей полиморфного участка (A1166C) гена сосудистого рецептора (тип 1) ангиотензина II проводилось выделение геномной ДНК из венозной крови обследуемых методом фенол-хлороформной экстракции [7]. Термостабильную ДНК-полимеразу Taq получили от НПО "Биотех" (Москва), рестриктазу BstDEI - от ТОО "Сибэнзим" (Новосибирск). Олигонуклеотидные праймеры синтезированы в ЗАО "Синтол" (Москва). Полиморфный участок гена AT2R1 амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в 50 мкл буфера, содержащего 67 мМ трис-HCl pH 8,8; 16,6 мМ сульфат аммония, 0,01% твин-20, 2 мМ хлорид магния, 0,2 мМ каждого dNTP, по 66 нг праймеров:

AT 1R-L (5'-CCTGCACCATGTTTTGAGGTTGAGTGAC-3') и AT 1R-R (5'-AAAATAACAGGACAAAAGCAGGCTAGGGAG-3'), 2,5 ед. ДНК-полимеразы Taq, 50-100 нг геномной ДНК. Амплификацию полиморфного участка гена проводили на амплификаторе PHC-2 (фирма "Techne", Великобритания) по следующей программе: первый цикл - 94?С/3 мин, 35 циклов - 94?С/1 мин, 65?С/1 мин, 72?С/2 мин, последний цикл - 72?С/6 мин.

Для идентификации аллелей к 15 мкл амплификационной смеси добавляли 2 мкл 10-кратного буфера G (ТОО "Сибэнзим", Новосибирск), содержащего 10 мМ трис-HCl pH 7,5, 10 мМ хлорид магния, 2 мкл БСА (1 мг/мл) и 1 мкл рестриктазы BstDEI (2 ед/мкл). Пробы выдерживались в течение ночи при 60?С. Продукты расщепления разделяли с помощью электрофореза в 2% агарозном либо в 6% полиакриламидном геле. Агарозный гель окрашивали бромистым этидием, полиакриламидный - серебром [8]. Сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов гена AT2R1 в группах обследованных проводили как описано ранее [9]. Статистический анализ осуществлялся с использованием статистического пакета SPSS. Для протяженных переменных рассчитывали средние величины и их ошибки. Распределение по полу, курению, наличию гипертонии среди трех генотипов больных исследовали с использованием таблиц сопряженности и критериев x₂ Пирсона и tau-beta Кенделла. Однофакторный дисперсионный анализ проводили для сравнения протяженных переменных в зависимости от генотипа. Рассчитывали критерий F Фишера. Статистически значимыми считали значения при p<0,05.

Результаты исследования

В результате амплификации участка ДНК, содержащего полиморфную последовательность A1166C гена AT2R1, получается фрагмент длиной 352 пары нуклеотидов (п.н.). Фрагмент ДНК, содержащий аллель C1166, расщепляется рестриктазой BstDEI, образуя продукты размером 114 и 238 п.н., в то время как фрагмент ДНК, содержащий аллель A1166, остается нерасщепленным. Наличие фрагмента длиной 352 п.н. после обработки BstDEI соответствует генотипу AA, двух фрагментов (114 и 238 п.н.) - генотипу CC и трех (114, 238 и 352 п.н.) - гетерозиготе AC. Распределение частот выявления генотипов (полиморфный участок A1166C) в целом по группе оказалось следущим: AA - 53,4%, AC - 34,2%, CC - 12,3%; в группе контроля - 66, 27 и 7% соответственно (различия между группами недостоверны). В то же время частота выявления аллелей различалась - в здоровой популяции аллель A встречался чаще, чем у больных ИБС (79,5% против 70,5%; p=0,037), тогда как аллель C у здоровых встречался реже (20,5 и 29,5%; p=0,037).

В табл. 1 представлена клиническая характеристика больных с различными генотипами гена AT2R1. При сравнении отмечена достоверно большая частота выявления аллеля C и генотипа CC и AC среди больных (c2=6,70;p=0,035), имевших в анамнезе инфаркт миокарда (AA - 35,7%, AC - 42,9%, CC - 21,4%), однако связь этих параметров оказалась не очень сильной (tau-beta Кенделла=0,289; p=0,008).

Гемостазиологическая дисфункция эндотелия и полиморфизм гена AT2R1

Результаты сравнения параметров, характеризующих состояние системы гемостаза у больных с различными генотипами гена AT2R1, представлены в табл.2. Анализ связи полиморфизма гена AT2R1 с уровнем факторов гемостаза показал, что генотип CC коррелирует с более высоким уровнем альфа₂-антиплазмина - главного ингибитора и с увеличением концентрации протеина C при венозной окклюзии (см. рисунок 1), что, по нашим данным, коррелирует с нарушением утилизации тромбина эндотелием.

Таблица 1. Клиническая характеристика больных ИБС с различными генотипами гена AT2R1 (полиморфный участок A1166C)
Показатель	Генотип AA (n=39)	Генотип AC (n=25)	Генотип CC (n=9)	X2	P	tau - beta Кенделла	P
Пол (муж/жен)	24/15	14/11	4/5	0,911	нд	0,099	нд
Отягощенная наследственность	12	13	3	5,996	0,050	0,143	нд
Инфаркт миокарда в анамнезе	10	12	6	6,701	0,035	0,289	0,008
Kурение	18	11	1	3,842	нд	-0,154	нд
Гиперлипидемия	18	7	3	0,685	нд	-0,116	нд
Гипертония	36	19	8	3,364	нд	-0,123	нд

Таблица 2. Показатели системы гемостаза в группах больных с различными генотипами гена AT2R1 (полиморфный участок A1166C)
Показатель	Генотип AA (n=39)	Генотип AC (n=25)	Генотип CC (n=9)	P
Плазминоген, %	104,0 2,2	113,5 3,8	109,9 4,5	нд
Антиплазмин исходно, %	100,7 2,12	104,9 2,06	113,3 5,56	0,035
Протеин C исходно, %	120,6 4,50	121,8 6,00	124,0 8,45	нд
Динамика протеина C при венозной окклюзии, %	-4,7 1,41	-2,7 1,67	10,4 11,85	0,012
Фактор Виллебранда исходно, %	112,0 6,74	116,9 7,60	104,3 18,5	нд
Динамика фактора Виллебранда при венозной окклюзии, %	-4,0 5,66	-11,0 4,08	-8,0 12,95	нд
Ингибитор активатора плазминогена, МЕ	4,0 0,3	4,6 0,5	5,3 0,6	нд
Антитромбин III, %	102,9 2,4	102,6 4,1	104,4 4,8	нд
Фибриноген, г/л	3,63 0,17	4,09 0,24	3,86 0,48	нд
D -димер, мкг/мл	296,9 40,8	322,4 57,3	276,7 54,1	нд

Далее...