Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://kodomo.fbb.msu.ru/FBB/year_02/science_1/Nilov.doc Дата изменения: Wed Nov 12 16:02:38 2003 Дата индексирования: Tue Oct 2 10:24:50 2012 Кодировка: koi8-r Поисковые слова: m 8

Московский Государственный Университет им. М. В. Ломоносова
Факультет Биоинженерии и Биоинформатики



Реконструкция трехмерной структуры пенициллинамидазы из Providencia
rettgeri







самостоятельная научная работа
студента 2-го курса
Нилова Дмитрия Константиновича



Руководители:
к.х.н., м.н.с. Г. Г. Чилов
д.х.н., проф. В. К. Швядас



Москва, 2003 г.
Содержание

|1.Аннотация........................... |2 |
|2.Введение.............................. |3 |
|3.Обзор литературы......................... |4 |
|3.1 Свойства пенициллинамидазы ................ |4 |
|3.2 Первичная структура пенициллинамидазы ........... |5 |
|3.3 Пространственная структура пенициллинамидазы....... |6 |
|3.4 Структура активного центра пенициллинамидазы........ |6 |
|3.5 Механизм катализа...................... |7 |
|4. Постановка цели работы..................... |9 |
|5. Экспериментальная часть...................... |9 |
|6. Обсуждение результатов..................... |11 |
|6.1 Построение трехмерной четвертичной структуры | |
|пенициллинамидазы из Providencia rettgeri ........... |11 |
|6.2 Оценка качества построенной трехмерной структуры........ |20 |
|6.3 Сравнение четвертичной структуры ПА из P.rettgeri c | |
|четвертичной структурой фермента из E.coli........... |22 |
|7.Выводы............................ |25 |
|8.Список литературы........................... |26 |










1. Аннотация

Фермент пенициллинамидаза (ПА) из E.coli используется в синтезе
антибиотиков. Поэтому изучение ПА из других организмов представляет научный
и коммерческий интерес.
В результате работы была построена четвертичная структура
пенициллинамидазы из Providencia rettgeri по известной структуре фермента
из Escherichia coli , оценено качество построенной модели и произведено
сравнение 3D-структур пенициллинамидаз из P.rettgeri и E.coli .
Было показано, что с помощью программы SWISS-MODEL можно построить
достаточно качественную четвертичную структуру данного белка, исходя из его
первичной структуры и известной четвертичной структуры 'матрицы'. Отличие
смоделированной структуры от экспериментальной (среднеквадратичное
отклонение 1.3 е) находилось в пределах ошибки эксперимента (2.5 е по
данным рентгеноструктурного анализа).
Было установлено высокое сходство трехмерных структур пенициллинамидаз из
P.rettgeri и E.coli, в особенности, сходство их активных центров, наводящее
на предположение о схожей субстратной специфичности ферментов.

2. Введение

Пенициллинамидаза (penicillin amidase, penicillin acylase, penicillin
amidohydrolase) известна как фермент, используемый в производстве
антибиотиков (рис.1). Научный интерес к ПА обусловлен уникальными
каталитическими свойствами и механизмом катализа. На примере ПА из E.coli
показано, что фермент обладает широкой субстратной специфичностью и может
быть использован для решения задач тонкого органического синтеза.
Сравнительное изучение ПА из разных организмов представляет значительный
интерес, так как, с одной стороны, может дать важную информацию о
неизвестном ранее механизме биокатализа, и, с другой стороны, выявить новые
области практического использования этой группы ферментов.

[pic]
Рис. 1 : Фермент пенициллинамидаза катализирует синтез антибиотиков из
активированных производных аминокислот и ядер антибиотиков.

3. Обзор литературы
3.1 Свойства пенициллинамидазы
Пенициллинамидаза (ПА) относится к классу гидролаз, подклассу
амидогидролаз (К.Ф.: 3.5.1.11) и известна в основном как катализатор
гидролиза амидной связи в антибиотиках пенициллинового ряда,(рис.2).


[pic]
Рис. 2: Фермент пенициллинамидаза катализирует гидролиз амидной связи.

Уникальность свойств ПА заключается в том, что они катализируют
расщепление только одной, более стабильной из двух амидных связей
пенициллина.
Впервые ПА выделили в 50-х годах из грибов Penicillium chrysogenum и
Aspergillus oryzae . В дальнейшем ее обнаружили у разных микроорганизмов.
Ферменты из разных продуцентов отличаются не только по субстратной
специфичности, но, вероятно, и по физиологической роли.
Физиологическая роль ПА до настоящего времени точно не установлена.
Существует несколько предположений: резистентность к пенициллинам,
метаболизирование фенилуксусной кислоты (ФУК) в качестве единственного
источника углерода и энергии, связь с белковым метаболизмом клетки.

3.2 Первичная структура пенициллинамидазы
ПА из E.coli является одним из первых ферментов, для которых первичная
структура была определена методом секвенирования гена и впоследствии хорошо
изучен биосинтез.
Зрелый фермент из E.coli- гетеродимер, состоящий из (- и (- цепей.
Предшественник синтезируется как полипептид, состоящий из сигнального
пептида, содержащего 26 аминокислот (а.к.), а также (- и (-субъединиц (209
а.к. и 557 а.к., соответственно), разделенных эндопептидом (54 а.к.).
Сначала устраняется сигнальный пептид, после этого происходит расщепление
предшественника на (-субъединицу и (-субъединицу, связанную с эндопептидом.
Дальнейшее созревание активной ПА характеризуется последующим удалением
эндопептида, в результате чего образуется зрелая (-субъединица. При этом (-
субъединица сворачивается первой и действует как матрица для сворачивания (-
субъединицы [1], (Рис.3).
[pic]
Рис. 3: Созревание пенициллинамидазы. Предшественник состоит из сигнального
пептида (sp) и А- и В-субъединиц, разделенных эндопептидом (ep). В процессе
самосплайсинга удаляются сигнальный пептид и эндопептид. Зрелый белок
состоит из А- и В-субъединиц. N-концевой серин В-цепи является
каталитически активным остатком.

До настоящего времени также определены первичные структуры методом
секвенирования гена ПА из A.faecalis, K.citrophila, P.rettgeri, A.viscosus,
B.megaterium и показано, что эти ферменты обладают высокой степенью
гомологичности. Авторы сопоставили их аминокислотные последовательности и
обнаружили много высококонсервативных участков на протяжении как (-, так и
(-цепи ферментов, большинство из которых, если исходить из трехмерной
структуры ПА из E.coli, находятся вблизи активного центра.
Следует отметить, что N-концевой аминокислотный остаток (-цепи всех
рассмотренных ПА является серин (каталитически активный остаток).

3.3 Пространственная структура пенициллинамидазы
Рентгеноструктурный анализ (РСА) ПА из E.coli был опубликован в 1995
году. Фермент имеет форму почки в поперечном сечении, с глубокой
чашеобразной выемкой по центру. Гетеродимер имеет усредненные размеры
70x50x55е и состоит из двух тесно переплетенных цепей (?- и ?-субъединицы).
Отдельные субъединицы не связаны ковалентно. Для проявления ферментативной
активности ПА из E.coli и P.rettgeri обязательно необходимы обе
субъединицы [2], (Рис.4)

[pic]

Рис. 4: Пространственная структура пенициллинамидазы. ПА состоит из двух
цепей. А-субъединица обозначена красным цветом, В-субъединица- синим.


3.4 Структура активного центра пенициллинамидазы
Участок связывания ацильной части субстрата образован многочисленными
ароматическими структурами и гидрофобными боковыми радикалами аминокислот.
При связывании ингибитора его фенилацетильная часть погружается в этот
гидрофобный "карман", а карбоксильная группа ориентируется к растворителю и
близка к каталитическому сериновому остатку (1, расположенному в устье
связывающего кармана [3, 4],(Рис.5).
Связывание нуклеофила с ферментом недостаточно изучено.

[pic]

Рис. 5: Активный центр пенициллинамидазы из E. coli. Помеченные а.к.
остатки участвуют в связывании фермента с субстратом (Arg145A, Phe146A,
Ser1B, Gln23B, Phe24B, Ala69B, Phe241B, Arg263B). Ser1B является
каталитически активным а.к. остатком.


3.5 Механизм катализа
При взаимодействии пенициллинамидазы с субстратом (рис.6) кислород
гидроксильной группы серина В1 образует связь с карбонильным углеродом
субстрата. При этом а. к. остатки AlaB69 и AsnB241 стабилизируют
отрицательный заряд на кислороде субстрата. Далее происходит отщепление
амина и нуклеофильное присоединение воды, в результате которого образуется
кислота [5].
[pic]
Рис. 6: Механизм катализа гидролиза амидной связи.

Пенициллинамидазы из разных источников в принципе отличаются по своим
каталитическим свойствам. Поэтому можно ожидать, что отдельные ферменты
этой группы могут быть использованы для решения различных задач.



4. Постановка цели работы

Задача работы состояла в построении трехмерной четвертичной структуры
пенициллинамидазы из Providencia rettgeri по известной структуре фермента
из Escherichia coli, оценке качества построенной модели и сравнении 3D-
структур пенициллинамидаз из P.rettgeri и E.coli.

5. Экспериментальная часть
1) Поиск белковых последовательностей пенициллинамидаз
Белковые последовательности искались в FASTA-формате с помощью системы
поиска SRS (http://www.srs.ebi.ac.uk) в банке spTrembl по видовому названию
(последовательность ПА из P.rettgeri) и с помощью системы поиска Entrez в
банке Swiss-Prot (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) по К.Ф. 3.5.1.11-
амидогидролазы (последовательность предшественника ПА из E.coli).

2) Поиск PDB-файлов пенициллинамидаз из E.coli
PDB-файлы пенициллинамидаз из E.coli искались в банке PROTEIN DATA BANK
(http://www.rcsb.org) в качестве предполагаемых матриц по К.Ф. 3.5.1.11.
Брались также последовательности этих белков в FASTA-формате из PDB-файлов
(опция Download Structures or Sequences(FASTA format).

3) Выравнивание
Парные выравнивания проводились на сервере GeneBee-Molecular Biology
Server (http://www.belozersky.msu.ru) с помощью программы AliBee-Multiple
alignment белковой последовательности предшественника из E. coli с каждым
ферментом из E.coli из PROTEIN DATA BANK.

4) Построение трехмерной структуры
Для построения трехмерной структуры использовался сервис SWISS-MODEL
(http://swissmodel.expasy.org/), расположенный на сервере швейцарского
института биоинформатики ExPASy Molecular Biology Server
(http://www.expasy.org). Чтобы смоделировать белок, состоящий из двух
субъединиц А и В (Oligomer modeling) был выбран режим Project mode. Для
того, чтобы создать файл-project в программе Swiss-PdbViewer
(http://kr.expasy.org/spdbv/) загружаются PDB-файл 1GK9 (c вырезанной
информацией о гетероатомах) и последовательность ПА из P. rettgeri. Затем
последовательность выравнивается с матрицей (Fit Raw Sequence).
Выравнивание подправлялось вручную так, чтобы в последовательности матрицы
не было делеций (Window( Alignment). Таким образом был создан файл
(Project.pdb: http://kodomo.cmm.msu.ru/~nilov), отправленный на сервер
SWISS-MODEL.
Полученный результат- трехмерная структура пенициллинамидазы из P.
rettgeri (файл PA-from-P.rettgeri.pdb: http://kodomo.cmm.msu.ru/~nilov ).

5) Поиск PDB-файла пенициллинамидазы из P.rettgeri
PDB-файл пенициллинамидазы из P.rettgeri (ID: 1CP9) искался в банке
PROTEIN DATA BANK (http://www.rcsb.org) по К.Ф. 3.5.1.11.

6) Подсчет среднеквадратичного отклонения
Среднеквадратичное отклонение (RMS) атомов построенной ПА от ПА из
P.rettgeri из банка PROTEIN DATA BANK (ID: 1CP9) подсчитывалось с помощью
программ Swiss-PdbViewer и g_rmsf.
RMS для всех атомов и отдельно для С-альфа атомов подсчитывалось с
помощью программы Swiss-PdbViewer. Для этого в программе загружаются
файлы PA-from-P.rettgeri.pdb (с предварительно вырезанной информацией о
матрице) и 1CP9.ent. Затем загруженные белки выравниваются (Magic Fit) и
подсчитывается среднеквадратичное отклонение (Calculate RMS).
RMS для каждого а.к. остатка подсчитывалось с помощью программы g_rmsf из
пакета программ GROMACS 3.1.4 (http://www.gromacs.org).

7) Визуализация трехмерных структур
Для визуализации трехмерных структур и создания рисунков использовалась
программа VMD (Visual Molecular Dynamics)
(http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/).

6. Обсуждение результатов

6.1 Построение трехмерной четвертичной структуры пенициллинамидазы из
Providencia rettgeri

Пенициллинамидазы из P.rettgeri и E.coli обладают высокой степенью
сходства, поэтому, зная трехмерную структуру фермента из E.coli, можно
смоделировать по аналогии трехмерную четвертичную структуру ПА из
P.rettgeri, исходя из известной первичной структуры этого белка (Рис.7,
Accession number в банке SpTrEMBL: Q7WZI9).

| |
|>ПА из Providencia rettgeri |
| |
|Сигнальный пептид: |
|MKKHLISIAIVLSLSSLSLSSFS |
| |
|А-субъединица |
|QSTQIKIERDNYGVPHIYANDTYSLFYGYGYAVAQDRLFQMEMAKRSTQGTVSEVFGKDYISFDKEIRNN|
|YW |
|PDSIHKQINQLPSQEQDILRGYADGMNAWIKQINTKPDDLMPKQFIDYDFLPSQWTSFDVAMIMVGTMAN|
|RF |
|SDMNSEIDNLALLTALKDKYGEQLGVEFFNQINWLNNPNAPTTISSEEFTYSD SQKTKNIS |
| |
|Эндопептид: |
|QLNQISDYRLTAPMFERTAKDTTGKVLALSSQENNALIAKQYEQSGANGLAGYPTT |
| |
|В-субъединица: |
|SNVWLVGKTKASGAKAILLNGPQFGWFNPAYTYGIGLHGAGFNIVGNTPFAYPAILFGHNGHVSWGSTAG|
|FG |
|DGVDIFAEQVSPEDPNSYLHQGQWKKMLSRQETLNVKGEQPITFEIYRTVHGNVVKRDKTTHTAYSKARA|
|W |
|DGKELTSLMAWVKQGQAQNWQQWLDQAQNQALTINWYYADKDGNIGYVHTGHYPDRQINHDPRLPVSGT |
|GEWDWKGIQPFANNPKVYNPKSGYIANWNNSPAKNYPASDLFAFLWGSADRVKEIDNRIEAYDKLTADDM|
| |
|WAILQQTSRVDLNHRLFTPFLTQATQGLPSNDNSVKLVSMLQQWDGINQLSSDGKHYIHPGSAILDIWLK|
|EML |
|KATLGQTVPAPFDKWYLASGYETTQEGPTGSLNISTGAKLLYESLLEDKSPISQSIDLFSGQPQNDVIRK|
|TLNTT |
|YQKMIEKYGDNPANWQTPATALTFRENNFFGIPQALPQENFHQNEYHNRGTENDLIVFTEEGVSAWDVVA|
|PG |
|QSGFISPQGKPSPHYQDQLSLYQQFGKKPLWLNSEDVAPYIESTETLIIER |

Рис.7: Белковая последовательность ПА из P.rettgeri.

Для моделирования требовался PDB-файл, содержащий 3D-структуру ПА из
E.coli, в качестве матрицы (template). Всего было найдено 23 файла ( ID:
1AI4, 1AI5, 1AI6, 1AI7, 1AJN, 1AJP, 1AJQ, 1E3A, 1FXH, 1FXV, 1GK9, 1GKF,
1GM7, 1GM8, 1GM9, 1H2G, 1JX9, 1K5Q, 1K5S, 1KEC, 1PNK, 1PNL, 1PNM).
Среди белков из найденных PDB-файлов были нормальные зрелые ферменты,
ферменты-мутанты и один белок с невырезанным эндопептидом. Из этих файлов
нужно было выбрать один, наиболее подходящий в качестве матрицы. Он должен
был иметь следующие качества: в белке не должно было быть мутаций, в PDB-
файле должно было присутствовать как можно больше аминокислот (в PDB-файле
могут отсутствовать аминокислоты на концах белка из-за невозможности точно
определить их координаты), разрешение (resolution) должно быть как можно
меньше. А- и В-субъединицы фермента из P.rettgeri немного короче
соответственно А- и В-субъединиц фермента из E. coli (P.rettgeri- A:205
остатков, В: 553 остатка; E.coli- А:209 остатков, В: 557 остатков). Поэтому
в качестве матрицы подходили зрелые ферменты без мутаций.
Для того, чтобы определить, есть ли в белке мутации, была взята белковая
последовательность предшественника ПА из E.coli (Accession number в банке
Swiss-Prot: P06875) в FASTA-формате (Рис.8 ) и сделаны парные выравнивания
этой последовательности с каждым ферментом из E.coli из PROTEIN DATA BANK.

| |
|>ПА Escherichia coli (предшественник) |
| |
|Сигнальный пептид: |
|MKNRNRMIVNCVTASLMYYWSLPALA |
| |
|А-субъединица |
|EQSSSEIKIVRDEYGMPHIYANDTWHLFYGYGYVVAQDRLFQMEMARRSTQGTVAEVLGKDFVKFDKDIR|
|R |
|NYWPDAIRAQIAALSPEDMSILQGYADGMNAWIDKVNTNPETLLPKQFNTFGFTPKRWEPFDVAMIFVGT|
|M |
|ANRFSDSTSEIDNLALLTALKDKYGVSQGMAVFNQLKWLVNPSAPTTIAVQESNYPLKFNQQNSQTA |
| |
|Эндопептид: |
|ALLPRYDLPAPMLDRPAKGADGALLALTAGKNRETIAAQFAQGGANGLAGYPTT |
| |
|В-субъединица: |
|SNMWVIGKSKAQDAKAIMVNGPQFGWYAPAYTYGIGLHGAGYDVTGNTPFAYPGLVFGHNGVISWGSTAG|
| |
|FGDDVDIFAERLSAEKPGYYLHNGKWVKMLSREETITVKNGQAETFTVWRTVHGNILQTDQTTQTAYAKS|
|R |
|AWDGKEVASLLAWTHQMKAKNWQEWTQQAAKQALTINWYYADVNGNIGYVHTGAYPDRQSGHDPRLPV |
|PGTGKWDWKGLLPFEMNPKVYNPQSGYIANWNNSPQKDYPASDLFAFLWGGADRVTEIDRLLEQKPRLTA|
|D |
|QAWDVIRQTSRQDLNLRLFLPTLQAATSGLTQSDPRRQLVETLTRWDGINLLNDDGKTWQQPGSAILNVW|
|LT |
|SMLKRTVVAAVPMPFDKWYSASGYETTQDGPTGSLNISVGAKILYEAVQGDKSPIPQAVDLFAGKPQQEV|
|VL |
|AALEDTWETLSKRYGNNVSNWKTPAMALTFRANNFFGVPQAAAEETRHQAEYQNRGTENDMIVFSPTTSD|
|R |
|PVLAWDVVAPGQSGFIAPDGTVDKHYEDQLKMYENFGRKSLWLTKQDVEAHKESQEVLHVQR |

Рис.8: Белковая последовательность предшественника ПА из E.coli.

Была составлена таблица для 23 ферментов из PROTEIN DATA BANK, в которой
описываются лиганды, мутации, разрешение и а. к. остатки, представленные в
PDB-файлах, для каждого белка:

| | | |РАЗРЕ- |А. к. остатки, |
| |ЛИГАНДЫ |МУТАЦИИ |ШЕНИЕ |представленные |
| | | |(ангстре| |
|ID | | |мы) |в PDB- файле |
|1AI4 | | | | |
| |HAA |E165B(Q165|2.350 |A: SER3-THR208 |
| |2-(3,4-DIHYDROXYPHENYL)ACETIC |B | |B: SER1-ARG557 |
| |ACID | | | |
| | | | | |
| |[pic] | | | |
| | | | | |
| |CA CALCIUM ION | | | |
|1AI5 | | | | |
| |MNP 2-(3-NITROPHENYL)ACETIC |E165B(Q165|2.360 |A: SER3-THR208 |
| |ACID |B | |B: SER1-ARG557 |
| | | | | |
| |[pic] | | | |
| | | | | |
| |CA CALCIUM ION | | | |
|1AI6 | | | | |
| |APH 2-(4-HYDROXYPHENYL)ACETIC |E165B(Q165|2.550 |A: SER3-TYR197 |
| |ACID |B | |B: SER1-ARG557 |
| | | | | |
| |[pic] | | | |
| | | | | |
| |CA CALCIUM ION | | | |
|1AI7 | | | | |
| |IPH PHENOL |E165B(Q165|2.500 |A: SER3-THR208 |
| | |B | |B: SER1-ARG557 |
| |[pic] | | | |
| | | | | |
| |CA CALCIUM ION | | | |
|1AJN | | | | |
| |AAN 2-(4-NITROPHENYL)ACETIC ACID|E165B(Q165|2.360 |A: |
| | |B | |SER3-THR208 |
| |[pic] | | |B: |
| | | | |SER1-ARG557 |
| | | | | |
| |CA CALCIUM ION | | | |
|1AJP | | | | |
| |OMD |E165B(Q165|2.310 |A: |
| |2-(3,6-DIHYDROXYPHENYL)ACETIC |B | |SER3-THR208 |
| |ACID | | |B: |
| | | | |SER1-ARG557 |
| |[pic] | | | |
| | | | | |
| |CA CALCIUM ION | | | |
|1AJQ | | | | |
| |SPA THIOPHENEACETIC ACID |E165B(Q165|2.050 |A: |
| | |B | |SER3-THR208 |
| |[pic] | | |B: |
| | | | |SER1-ARG557 |
| | | | | |
| |CA CALCIUM ION | | | |
|1E3A | | | | |
| |EDO 1,2-ETHANEDIOL | |1.800 |SER3-ARG820 |
| | | | | |
| |[pic] | | | |
| | | | | |
| |CA CALCIUM ION | | | |
|1FXH | | | | |
| |PAC 2-PHENYLACETIC ACID |V148B(L148|1.970 |A: |
| |[pic] |B | |SER3-THR208 |
| | | | |B: |
| | |N241B(A241| |SER1-ARG557 |
| | |B | | |
| | | | | |
| |CA CALCIUM ION | | | |
|1FXV | | | | |
| |PNN PENICILLIN G |V148B(L148|2.250 |A: |
| | |B | |SER3-THR208 |
| |[pic] | | |B: |
| | |N241B(A241| |SER1-ARG557 |
| | |B | | |
| | | | | |
| |CA CALCIUM ION | | | |
|1GK9 | | | | |
| |EDO 1,2-ETHANEDIOL | |1.300 |A: |
| | | | |GLN2-ALA209 |
| |[pic] | | |B: |
| | | | |SER1-ARG557 |
| | | | | |
| |CA CALCIUM ION | | | |
|1GKF | | | | |
| |SME METHIONINE SULFOXIDE |M16A(X16A |1.410 |A: |
| | | | |SER3-ALA209 |
| |[pic] | | |B: |
| | | | |SER1-ARG557 |
| | | | | |
| | |N241B(A241| | |
| | |B | | |
| | | | | |
| |EDO 1,2-ETHANEDIOL | | | |
| | | | | |
| |[pic] | | | |
| | | | | |
| |CA CALCIUM ION | | | |
|1GM7 | | | | |
| | |M16A(X16A |1.450 |A: |
| |HETNAM SME METHIONINE | | |SER3-ALA209 |
| |SULFOXIDE | | |B: |
| | | | |SER1-ARG557 |
| |[pic] | | | |
| | | | | |
| | |N241B(A241| | |
| | |B | | |
| | | | | |
| |HETNAM EDO 1,2-ETHANEDIOL | | | |
| | | | | |
| |[pic] | | | |
| | | | | |
| | | | | |
| |HETNAM PNN PENICILLIN G | | | |
| |[pic] | | | |
| | | | | |
| |CA CALCIUM ION | | | |
|1GM8 | | | | |
| |SOX OXIDISED PENICILLIN G |N241B(A241|2.000 |A: |
| |[pic] |B | |SER3-ALA209 |
| | | | |B: |
| | | | |SER1-ARG557 |
| | | | | |
| |CA CALCIUM ION | | | |
|1GM9 | | | | |
| |SOX OXIDISED PENICILLIN G |E1A(Q1A |1.800 |A: |
| | | | |SER3-ALA209 |
| |[pic] | | |B: |
| | | | |SER1-ARG557 |
| | | | | |
| |EDO 1,2-ETHANEDIOL | | | |
| | | | | |
| |[pic] | | | |
| | | | | |
| |SME METHIONINE SULFOXIDE | | | |
| |[pic] | | | |
| | | | | |
| |CA CALCIUM ION | | | |
|1H2G | | | | |
| |EDO 1,2-ETHANEDIOL |F72B(L72B |2.000 |A: |
| |[pic] | | |SER3-GLN207 |
| | | | |B: |
| | | | |SER1-ARG557 |
| | | | | |
| |CA CALCIUM ION | | | |
|1JX9 | | | | |
| |CA CALCIUM ION |F24B(A24B |2.280 |A: |
| | | | |SER3-THR208 |
| | |V148B(L148| |B: |
| | |B | |SER1-ARG557 |
|1K5Q | | | | |
| |PAC 2-PHENYLACETIC ACID |F24B(A24B |2.340 |A: |
| |[pic] | | |SER3-THR208 |
| | |V148B(L148| |B: |
| | |B | |SER1-ARG557 |
| | | | | |
| |CA CALCIUM ION | | | |
|1K5S | | | | |
| |GRO R-2-PHENYL-PROPRIONIC ACID|F24B(A24B |2.430 |A: |
| | | | |SER3-THR208 |
| |[pic] |V148B(L148B| |B: |
| | | | |SER1-ARG557 |
| | | | | |
| |CA CALCIUM ION | | | |
|1KEC | | | | |
| |GRO R-2-PHENYL-PROPRIONIC ACID|F147A(Y147A|2.300 |A: |
| | | | |SER3-THR208 |
| |[pic] | | |B: |
| | | | |SER1-ARG557 |
| | | | | |
| | |V148B(L148B| | |
| | | | | |
| |CA CALCIUM ION | | | |
|1PNK | | | | |
| |CA CALCIUM ION | |1.900 |A: |
| | | | |SER3-SER195 |
| | | | |B: |
| | | | |SER1-ARG557 |
|1PNL | | | | |
| |PAC 2-PHENYLACETIC ACID | |2.500 |A: |
| |[pic] | | |SER3-SER195 |
| | | | |B: |
| | | | |SER1-ARG557 |
| | | | | |
| |CA CALCIUM ION | | | |
|1PNM | | | | |
| |PMS SULFINOTOLUENE | |2.500 |A: |
| |[pic] | | |SER3-SER195 |
| | | | |B: |
| | | | |SER1-ARG557 |
| | | | | |
| |CA CALCIUM ION | | | |


На основании этой таблицы в качестве матрицы была выбрана пенициллинамидаза
1GK9 (файл 1GK9.ent: http://kodomo.cmm.msu.ru/~nilov ), которая
представляет собой зрелый фермент без мутаций [6].
С помощью программы SWISS-MODEL [7, 8, 9] была построена трехмерная
четвертичная структура пенициллинамидазы из P.rettgeri (файл PA-from-
P.rettgeri.pdb: http://kodomo.cmm.msu.ru/~nilov/ ). На Рис.9 изображена
построенная модель.

[pic]

Рис. 9: Пространственная структура пенициллинамидазы из Providencia
rettgeri, построенная на сервере SWISS-MODEL. А-субъединица обозначена
зеленым цветом, В-субъединица- голубым.

При создании файла Project выравнивание, сделанное программой Swiss-
PdbViewer, оказалось не самым оптимальным, в отличие от выравнивания,
выдаваемого программой AliBee. Поэтому его пришлось редактировать вручную
для устранения делеции в последовательности матрицы (белковая
последовательность матрицы не должна содержать делеций) и улучшения
выравнивания В-цепи по образцу выравнивания (Рис.16), сделанного программой
AliBee (http://www.belozersky.msu.ru).
Преимущество ручного выравнивания видно при наложении 3D-структур ПА из
P.rettgeri, построенной на сервере SWISS-MODEL и ПА из P.rettgeri,
полученной медодом рентгеноструктурного анализа (ID в PROTEIN DATA
BANK:1CP9, файл 1CP9.ent (http://kodomo.cmm.msu.ru/~nilov ) ).
На Рис.10 изображено наложение структур пенициллинамидаз 1CP9 и
полученной на сервере SWISS-MODEL без применения ручного выравнивания В-
цепей. Структуры плохо накладываются, а концы В-цепей не совпадают.
| | |
|[pic] |[pic] |
|А |В |

Рис.10: Наложение структур пенициллинамидаз 1CP9 и полученной на сервере
SWISS-MODEL при автоматическом выравнивании последовательностей. Синим
цветом обозначена ПА 1CP9, оранжевым- построенная ПА. Видно, что структура
смоделирована не оптимальным образом.

На рис.11 изображена структура, смоделированная по результатам
выравнивания, выдаваемого программой AliBee.

[pic]

Рис.11: Наложение структур пенициллинамидаз 1CP9 и полученной на сервере
SWISS-MODEL с применением оптимального выравнивания последовательностей.
Синим цветом обозначена ПА 1CP9, оранжевым- построенная ПА.



6.2 Оценка качества построенной трехмерной структуры

Для оценки качества построенная модель сравнивалась с трехмерной
структурой ПА из P.rettgeri, полученной методом рентгеноструктурного
анализа, из PROTEIN DATA BANK (ID: 1CP9- файл 1CP9.ent
(http://kodomo.cmm.msu.ru/~nilov )).
Среднеквадратичное отклонение (RMS) атомов построенной ПА от ПА 1CP9,
полученное с помощью программы Swiss-PdbViewer составляет 1,25 е для С-
альфа атомов и 1,33 е для всех атомов.
Подсчитывалось также RMS для каждого а.к. остатка с помощью программы
g_rmsf из пакета программ GROMACS 3.1.4. Зависимость RMS от номера остатка
изображена на Рис.12, 13.
Подсчитанное отклонение приемлемо, поскольку экспериментальное значение
разрешения (resolution) для ПА 1CP9 составляет 2,50е.
Следовательно, построенная трехмерная структура близка к
экспериментальной и является достаточно качественной.
Визуализация качества построенной трехмерной структуры с помощью В-
фактора представлена на Рис.14. В-фактор пропорционален RMS атомов
построенной структуры от атомов ПА 1CP9. Из рисунка видно хорошее качество
построенной модели. Структуры обладают значительным сходством в области
активного центра.
Кроме того, что построенная структура является достаточно качественной, в
полученном PDB-файле PA-from-P.rettgeri.pdb имеются все а.к. остатки ПА из
P.rettgeri, тогда как в PDB-файле ПА из P.rettgeri из PROTEIN DATA BANK А-
цепь начинается со второго остатка и заканчивается 197-ым (Всего А-цепь ПА
из P.rettgeri содержит 205 остатков).

[pic] Рис.12: Среднеквадратичное отклонение остатков в А-цепи.


[pic] Рис.13: Среднеквадратичное отклонение остатков в В-цепи.





[pic]

Рис.14: Визуализация качества моделирования с помощью В-фактора. Значения В-
фактора для каждого цвета: оранжевый- 100-75, желтый- 75-50, зеленый- 50-
25, голубой- 25-10, синий- <10. Из рисунка видно хорошее качество
построенной модели. Структуры обладают значительным сходством в области
активного центра.



6.3Сравнение четвертичной структуры ПА из P.rettgeri с
четвертичной структурой фермента из E.coli

Пенициллинамидазы из P.rettgeri и E.coli обладают удовлетворительной
степенью сходства (гомология в аминокислотной последовательности белков
составляет 75%). Имеется много высоко консервативных участков на протяжении
(- и (-цепи ферментов и, что особенно важно, вблизи активного центра. Это
видно из выравниваний белковой последовательности ПА из P.rettgeri c
последовательностью из E.coli (Рис.15, 16).

| |
|.*.+*** **.**.********+ *******.************+*******.**.** |
|P.rettgeri ( 1) |
|--QSTQIKIERDNYGVPHIYANDTYSLFYGYGYAVAQDRLFQMEMAKRSTQGTVSEVFGK |
|E.coli ( 1) |
|eqSSSEIKIVRDEYGMPHIYANDTWHLFYGYGYVVAQDRLFQMEMARRSTQGTVAEVLGK |
| |
|*++.***+**.*****.*. ** * ++..**.********** .+**.*+ *+**** |
|P.rettgeri ( 59) |
|DYISFDKEIRNNYWPDSIHKQINQLPSQEQDILRGYADGMNAWIKQINTKPDDLMPKQFI |
|E.coli ( 61) |
|DFVKFDKDIRRNYWPDAIRAQIAALSPEDMSILQGYADGMNAWIDKVNTNPETLLPKQFN |
| |
|+ * *..* ******.********** .***************** . *. ***+.* |
|P.rettgeri ( 119) |
|DYDFLPSQWTSFDVAMIMVGTMANRFSDMNSEIDNLALLTALKDKYGEQLGVEFFNQINW |
|E.coli ( 121) |
|TFGFTPKRWEPFDVAMIFVGTMANRFSDSTSEIDNLALLTALKDKYGVSQGMAVFNQLKW |
| |
|* **.*****. +* .* . .*.... . |
|P.rettgeri ( 179) LNNPNAPTTISSEEFTY--SDSQKTKNIS |
|E.coli ( 181) LVNPSAPTTIAVQESNYplKFNQQNSQTA |

Рис. 15: Выравнивание А-цепи ПА из P.rettgeri с А-цепью ПА из E.coli.
Помечены а.к. остатки активного центра: Arg143A и Phe144A.


| |
| |
|**.*.+**.**. ****+.*******+ *************+.+.********.+.**** |
|P.rettgeri ( 1) |
|SNVWLVGKTKASGAKAILLNGPQFGWFNPAYTYGIGLHGAGFNIVGNTPFAYPAILFGHN |
|E.coli ( 1) |
|SNMWVIGKSKAQDAKAIMVNGPQFGWYAPAYTYGIGLHGAGYDVTGNTPFAYPGLVFGHN |
| |
|* +********** ******..* * *. ***.*.* *****+**+.**. * ** ++* |
|P.rettgeri ( 61) |
|GHVSWGSTAGFGDGVDIFAEQVSPEDPNSYLHQGQWKKMLSRQETLNVKGEQPITFEIYR |
|E.coli ( 61) |
|GVISWGSTAGFGDDVDIFAERLSAEKPGYYLHNGKWVKMLSREETITVKNGQAETFTVWR |
| |
|*****+.. *.**.***.*.*******..**+**. * .*.***+* .** .******** |
|P.rettgeri ( 121) |
|TVHGNVVKRDKTTHTAYSKARAWDGKELTSLMAWVKQGQAQNWQQWLDQAQNQALTINWY |
|E.coli ( 121) |
|TVHGNILQTDQTTQTAYAKSRAWDGKEVASLLAWTHQMKAKNWQEWTQQAAKQALTINWY |
| |
|*** .********* ***** .******* ***.*****+ ** *******.******* |
|P.rettgeri ( 181) |
|YADKDGNIGYVHTGHYPDRQINHDPRLPVSGTGEWDWKGIQPFANNPKVYNPKSGYIANW |
|E.coli ( 181) |
|YADVNGNIGYVHTGAYPDRQSGHDPRLPVPGTGKWDWKGLLPFEMNPKVYNPQSGYIANW |
| |
|**** *.************.**** ***. +* +****. * ++.**** *** *** |
|P.rettgeri ( 241) |
|NNSPAKNYPASDLFAFLWGSADRVKEIDNRIEAYDKLTADDMWAILQQTSRVDLNHRLFT |
|E.coli ( 241) |
|NNSPQKDYPASDLFAFLWGGADRVTEIDRLLEQKPRLTADQAWDVIRQTSRQDLNLRLFL |
| |
|* * **.** ..* .**. * .***** *..*** + .******.+** .*** *. |
|P.rettgeri ( 301) |
|PFLTQATQGLPSNDNSVKLVSMLQQWDGINQLSSDGKHYIHPGSAILDIWLKEMLKATLG |
|E.coli ( 301) |
|PTLQAATSGLTQSDPRRQLVETLTRWDGINLLNDDGKTWQQPGSAILNVWLTSMLKRTVV |
| |
|.** ****** ********+*********.***+***.. ***** *.+***.*.**. |
|P.rettgeri ( 361) |
|QTVPAPFDKWYLASGYETTQEGPTGSLNISTGAKLLYESLLEDKSPISQSIDLFSGQPQN |
|E.coli ( 361) |
|AAVPMPFDKWYSASGYETTQDGPTGSLNISVGAKILYEAVQGDKSPIPQAVDLFAGKPQQ |
| |
|+*+ .*. *++ + .+**.* .**.*** ***** *****+*** +*. ** **.*** |
|P.rettgeri ( 421) |
|DVIRKTLNTTYQKMIEKYGDNPANWQTPATALTFRENNFFGIPQALPQENFHQNEYHNRG |
|E.coli ( 421) |
|EVVLAALEDTWETLSKRYGNNVSNWKTPAMALTFRANNFFGVPQAAAEETRHQAEYQNRG |
| |
|****+*** .+. * *************.*.* . **+***.+*+.**+* ***.. |
|P.rettgeri ( 481) |
|TENDLIVF----TEEGVSAWDVVAPGQSGFISPQGKPSPHYQDQLSLYQQFGKKPLWLNS |
|E.coli ( 481) |
|TENDMIVFspttSDRPVLAWDVVAPGQSGFIAPDGTVDKHYEDQLKMYENFGRKSLWLTK |
| |
|+** + ** *.* ++* |
|P.rettgeri ( 537) EDVAPYIESTETLIIER |
|E.coli ( 541) QDVEAHKESQEVLHVQR |

Рис. 16: Выравнивание B-цепи ПА из P.rettgeri с B-цепью ПА из E.coli.
Помечены а.к. остатки активного центра: Ser1B(каталитически активный а.к
остаток), Gln23B, Phe24B, Ala69B, Phe71B, Asn241B, Arg263B.
А.к. остатки активного центра ПА из P.rettgeri совпадают с остатками
активного центра ПА из E.coli [4]. Отличается только их нумерация в А-цепи.

Несмотря на то,что степень гомологии составляет только 75%, трехмерные
структуры пенициллинамидаз из P.rettgeri и E.coli (Рис.4,9) очень схожи.
RMS по С-альфа атомам составляет 0,72е.
Особенно важно сходство в структуре активного центра (Рис.17). Серин1В и
а.к. остатки, образующие оксианионную дырку, в ПА из P.rettgeri так же
расположены в пространстве, как и в ПА из E.coli.

[pic]

Рис. 17: Активный центр пенициллинамидазы из P.rettgeri. Помеченные а.к.
остатки участвуют в связывании фермента с субстратом (Arg143A, Phe144A,
Ser1B, Gln23B, Phe24B, Ala69B, Phe241B, Arg263B). Ser1B является
каталитически активным а.к. остатком.


Одним из лучших субстратов для пенициллинамидазы из E.coli является
пенициллин G (бензилпенициллин): Пенициллин G является также хорошим
субстратом для ПА из P.rettgeri (константа диссоциации комплекса фермента с
субстратом равна 0,002M 0,0000085М для ПА из E.coli и 0,002M для ПА из
P.rettgeri [10]).
Сходство активных центров дает основание полагать, что и другие субстраты
ПА из E.coli подходят для ПА из P.rettgeri.
7. Выводы

1) С помощью программы SWISS-MODEL была построена четвертичная структура
фермента пенициллинамидазы из Providencia rettgeri , исходя из его
первичной структуры и четвертичной структуры схожего фермента ПА из
Escherichia coli.

2) Среднеквадратичное отклонение (RMS) атомов 3D-структуры построенной ПА
от структуры ПА из P.rettgeri из PROTEIN DATA BANK, полученной методом
рентгеноструктурного анализа, составляет 1,25 е для С-альфа атомов и 1,33 е
для всех атомов, что находится в пределах экспериментальной ошибки
рентгеноструктурного анализа (2,50 е).

3) Несмотря на то, что гомология в аминокислотных последовательностях
пенициллинамидаз из E.coli и P.rettgeri составляет всего 75%, трехмерные
структуры этих белков очень схожи. Среднеквадратичное отклонение по С-альфа
атомам составляет 0,72е.

4) На основании построенной трехмерной структуры было показано, что
активный центр ПА из P.rettgeri и E.coli составляют одни и те же остатки (в
ПА из P.rettgeri: Arg143A, Phe144A, Ser1B, Gln23B, Phe24B, Ala69B, Phe241B,
Arg263B). Это наводит на предположение о схожей субстратной специфичности
ферментов.

8. Список литературы

[1] Sizmann D., Keilmann C. and Bock A. Primary structure requirements for
the maturation in vivo of penicillin acylase from E.coli ATCC 11105.
Eur. J. Biochem. 1990, 192, 143-151.
[2] Lindsay C.D. and Pain R.H. The folding and solution conformation of
penicillin G acylase. Eur. J. Biochem. 1990, 192, 133-141.
[3] Done S.H., Brannigan J.A., Moody P.C.E. and Hubbard R.E. Ligand-induced
conformational change in penicillin acylase. J. Mol. Biol. 1998, 284,
463-475.
[4] Mcdonough, M. A., Klei, H. E., Kelly, J. A.. Crystal Structure of
Penicillin G Acylasefrom the Bro1 Mutant Strain of Providencia Rettgeri.
Protein Science. 1999, 8, 1971-1981.
[5] Duggleby H.J., Tolley S.P., Hill C.P., Dodson E.J., Dodson G. and Moody
P.C.E. Penicillin acylase has a single-amino-acid catalytic center.
Nature. 1995, 373, 264-268.
[6] Mcvey, C. E., Walsh, M. A., Dodson, G. G., S, K., Brannigan, J. A..
Crystal Structures of Penicillin Acylase Enzyme-Substrate Complexes:
Structural Insights Into the Catalytic Mechanism. J.Mol.Biol. 2001, 313-
139.
[7] Schwede T, Kopp J, Guex N, and Peitsch MC. SWISS-MODEL: an automated
protein homology-modeling server.Nucleic Acids Research. 2003, 31, 3381-
3385.
[8] Guex, N. and Peitsch, M. C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An
environment for comparative protein modelling. Electrophoresis. 1997,
18, 2714-2723.
[9] Peitsch, M. C. Protein modeling by E-mail. Bio/Technology. 1995, 13,
658-660.
[10] Pramod B. Mahajan. Penicillin Acylases. Applied Biochemistry and
Biotechnology. 1984, 9, 537-554.
-----------------------
[pic]