Занятие 9. Пакет BLAST (продолжение)

1. Работа с программой getorf пакета EMBOSS

   Команда "tfm getorf" выдает справку, которую я записал в файл getorf.help. Для выполнения данного задания я использовал следующие значения параметров этой программы:
   -table 11 (задается использование бактериального кода)
   -minsize 30 (задается минимальная длина открытых рамок данной последовательности в нуклеотидах)
   -find 1 (задаем, что открытой рамкой является последовательность триплетов, начинающаяся со старт-кодона и заканчивающаяся стоп-кодоном)
   
   В итоге после выполнения команды
   
   getorf -table 11 -minsize 30 -find 1 -sequence d89965.entret
   
   получен файл с удовлетворяющими заданным условиям открытыми рамками. В нем пятая рамка соответствует приведенной в записи CDS, а тринадцатая - соответствующей записи Swiss-Prot.

2. Поиск некодирующих последовательностей программой BLASTN

   Необходимо было определить, сколько гомологов каждой из тРНК E.coli находит программа BLASTN в трех геномах бактерий Salmonella typhimurium LT2, Pasteurella multocida и Xanthomonas campestris.
   Программа blastn запускалась следующей командой:
   blastall -p blastn -d three -i trna_ecoli.fasta -o trna_out.txt -m 8
   
   Чтобы определить число находок, описанных в получившемся файле для каждой последовательности тРНК, был запущен специальный скрипт.
   
   В случае указания порога на E-value команда немного менялась:
   blastall -p blastn -d three -i trna_ecoli.fasta -o trna_out2.txt -m 8 -e 0.001
   
   Соответствующий скрипт.
   
   Результат выполнения упражения - в файле trna.xls.
   

3. Поиск некодирующих последовательностей программой megablast

   Необходимо было определить, сколько гомологов каждой из тРНК E.coli находит программа megablast и discontigous megablast в трех геномах бактерий Salmonella typhimurium LT2, Pasteurella multocida и Xanthomonas campestris.
   
   Командная строка, использованная для запуска megablast:
   megablast -d three -i trna_ecoli.fasta -o trna_mega.txt -m 8
   
   Соответствующий скрипт.
   
   Командная строка, использованная для запуска discontigous megablast:
   megablast -d three -i trna_ecoli.fasta -o trna_megad.txt -m 8 -D 2 -t 18 -W 11 -N 1
   
   Соответствующий скрипт.
   
   Использованы следующие параметры данной команды:
   -m 8 (задает табличный формат выдачи)
   -D 2 (задает тип выдачи, в данном случае "2" - стандартная выдача blast)
   -t 18 (Длина слов из последовательностей тРНК, которые будут искаться в геноме бактерий)
   -W 11 (Длина слов из генома бактерий, по которым ведется поиск)
   -N 1 (Тип разрывов в матрице (здесь - в тРНК), рекомендуется значение "1")
   
   Все результаты также лежат в файле из предыдущего упражнения.

4. Минимальный анализ результатов

   Для сравнения была взята тРНК lysQ и один из гомологичных ей участков в бактерии Xanthomonas campestris. Этой пары нет в выдачи megablast, так как эта программа ищет в геноме бактерий слова длиной 28, а таких длинных совпадений в приведенном примере нет.
   
   Ниже приведены значение полей записи EMBL, в которой проаннотирован найденный гомологичный участок:

   AC   AE012414; AE008922;
   DE   Xanthomonas campestris pv. campestris str. ATCC 33913,  section 322 of 460
   DE   of the complete genome.
   OS   Xanthomonas campestris pv. campestris str. ATCC 33913
   FT   tRNA            complement(7790..7865)
   FT                   /gene="XCC3013"
   FT                   /product="tRNA-Lys"
   FT                   /note="Found by tRNAscan"
   
   

   Скорее всего, tRNAscan - программа, находящая матрицы для тРНК в геномах.
   Этот гомологичный участок и исходная последовательность вырезаны в отдельные файлы, после чего выровнены программой needle. Выравнивание находится здесь. Его основные характеристики:

   Длина: 76
   Процент идентичности:  65/76 (85.5%)
   Процент сходства:  65/76 (85.5%)
   Гэпы:   0/76 ( 0.0%)
   Счет: 281.0
   

   Выравнивания программ blastn и needle практически совпадают, во втором случае спереди прибавился небольшой кусочек из трех "g". Достаточный высокий процент идентичности можно объяснить тем, что тРНК из-за своей важности в клеточных процессах очень консервативны.