Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://www.nature.web.ru/db/msg.html?mid=1179468&uri=index.html
Дата изменения: Unknown
Дата индексирования: Mon Apr 11 13:35:52 2016
Кодировка: Windows-1251

Поисковые слова: воздушные массы
Научная Сеть >> Исследование динамики биосинтеза антибиотиков штаммами Streptomyces chrysomallus с различным плазмидным статусом в погруженной и поверхностной культуре
Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина | Научные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение

Исследование динамики биосинтеза антибиотиков штаммами Streptomyces chrysomallus с различным плазмидным статусом в погруженной и поверхностной культуре

Ефрон-Коношенко Г.И.

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 1999-N6, стр. 6-11.

В начало...


Проведено исследование динамики образования одновременно двух антибиотических веществ различной структуры, синтезируемых одним видом стрептомицета. Сравнительное изучение накопления актиномицина С (АС) и макротетролидов (МТЛ) проводили в погруженной аэрируемой культуре и при поверхностном росте трех штаммов Streptomyces chrysomallus, обладающих различным плазмидным статусом, и их bld мутантов. Показано, что динамика образования АС и МТЛ различна при выращивании штаммов как в жидкой, так и на агаризованной среде. Максимальное образование АС и МТЛ приходиться на разные стадии развития S.chrysomallus, что, по-видимому, отражает различную физиологическую роль двух антибиотиков у этого микроорганизма. Характер накопления МТЛ культурами bld мутантов отличается от исходных штаммов. По уровню и динамике биосинтеза антибиотиков штамм S.chrysomallus ВКМ Ас-590 и его мутанты, содержащие плазмиды pSCH2 и pSCH3, отличаются от других штаммов.

Ключевые слова:

Streptomyces chrysomallus, дифференциация, биосинтез антибиотиков, актиномицин С, макротетролиды.

Стрептомицеты - почвенные грамположительные микроорганизмы, в природе адаптированные к колонизации твердых субстратов. Морфологическая дифференциация стрептомицетов сопровождается продукцией большого числа вторичных метаболитов, включая антибиотики [1, 2]. Признаки дифференциации стрептомицетов более ясно выражены в поверхностных культурах, но возможности исследования этих культур ограничены. Поэтому почти все данные о физиологических свойствах мицелия актиномицетов к настоящему времени получены с помощью периодических жидких культур [3]. В последние годы начато детальное исследование на агаризованных средах физиологии Streptomyces coelicolor, генетически наиболее исследованного представителя рода Streptomyces [4, 5].

Для различных штаммов Streptomyces chrysomallus характерен биосинтез актиномицина С и антибиотиков макротетролидов [6]. В то же время штаммы S.chrysomallus отличаются плазмидным статусом, структурой и свойствами плазмид, которые предположительно могут играть существенную роль в регуляции биосинтеза антибиотиков [7].

С целью дальнейшего изучения возможной роли плазмид в регуляции биосинтеза антибиотиков у S.chrysomallus, в настоящей работе проведено исследование образования антибиотиков рядом штаммов с различным плазмидным статусом и их bld мутантами как в периодических культурах, так и на агаризованных средах.

Материал и методы

Микроорганизмы, использованные в работе и их происхождение: S.chrysomallus ВКМ Ас-628 (АС+, МТЛ+, рМG200, ВКМ); S.chrysomallus 628 HI (АС-, МТЛ+, рМG200, [6]); S.chrysomallus ВКМ Ас-721 (АС+, МТЛ+, ВКМ); S.chrysomallus 721 HI (АС-, МТЛ+, [7]); S.chrysomallus ВКМ Ас-590 (АС+, МТЛ+, ВКМ); S.chrysomallus 590 Н1 (АС+, МТЛ+, pSCH2, ВКМ); S.chrysomallus 590 НБ (АС+, МТЛ+, pSCH3, ВКМ) (Н- нокардиоподобные мутанты, не образующие воздушный мицелий и споры, bald colony - bld [8], НБ- нокардиоподобный "белый" мутант, ВКМ - Всероссийская коллекция микроорганизмов).

Среды и условия культивирования. Для приготовления посевного материала культуры выращивали на гороховой среде с агаром в течение 7 дней при 28 ?С.

Для исследования биосинтеза антибиотиков микроорганизмы выращивали в жидкой и на агаризованной органической среде УЕМЕ [9], содержащей MgCl2 и 10% сахарозу, используемой при изучении свойств плазмид. Для поверхностных культур в чашки заливали по 24 мл агаризованной среды. Жидкие культуры выращивали в колбах с интенсивной аэрацией. Среды засевали посевным материалом из расчета 107-108 жизнеспособных колоний (ЖК) на 24 мл среды. Культуры выращивали при 28 ?С в течение 168 ч.

За ростом биомассы жидких культур следили по изменению оптической плотности гомогенизированных проб культур.

Экстракция антибиотиков. В исследуемый период времени отбирали по 6 мл жидкой культуры (из двух параллельных колб), добавляли по 10 мл хлороформа и интенсивно встряхивали 1 мин. Четвертую часть (6 мл) культуры на агаризованной среде (с двух параллельных чашек) измельчали вместе со средой и заливали 10 мл хлороформа. Культуры оставляли для экстракции в хлороформе в течение суток при комнатной температуре. Полученные экстракты отделяли и упаривали. Остаток экстрагировали 5 мл горячего гексана. Гексановую фракцию упаривали и растворяли в 10 мл хлороформа. В этой фракции определяли наличие МТЛ. Остаток после обработки гексаном, растворяли в 10 мл хлороформа и в этой фракции определяли содержание АС.

Количественное определение антибиотиков проводили спектрофотометрически на ФЭК Specol-10 (Германия) по калибровочным кривым. Для определения АС измеряли оптическую плотность экстракта при 445 нм (АС, использованный для построения калибровочной кривой, выделен и любезно предоставлен Т.И. Орловой). Количественное определение нактиновых соединений (макротетролиды + линейные предшественники), обозначенных как МТЛ, в экстрактах культур проводили модифицированным методом [10] с использованием пикрата аммония и хлороформа [11]. К 2,5 мл анализируемой пробы прибавляли 1,25 мл раствора пикрата аммония и интенсивно перемешивали. Смеси давали полностью расслоиться, отделяли органическую фазу, содержащую окрашенный комплекс МТЛ - катион-пикриновая кислота, высушивали безводным сульфатом натрия и измеряли оптическую плотность (при 337 нм). Препарат нонактина для калибровочной кривой получали из штамма S.chrysomallus subs. makrotetrolidi [12] при глубинном выращивании. Антибиотик представлял собой белые игольчатые кристаллы с т. пл. 142 ?С, идентификацию проводили с помощью масс-спектрометрии и комплексообразования с катионами [13].

Количество антибиотиков выражали в мкг на 10 мл экстракта.

Результаты, представленные в работе, типичны для ряда экспериментов. Каждый эксперимент повторяли не менее 3 раз.

Результаты исследований

В работе исследовали биосинтез антибиотиков тремя исходными штаммами S.chrysomallus, обладающими различным плазмидным статусом, и их bld мутантами. S.chrysomallus 628 содержит плазмиду pМG200. Эта плазмида, по-видимому, не связана с антибиотической активностью штамма [7]. Штамм 590 образует мутанты с плазмидами pSCH2 и pSCH3, которые, вероятно, играют существенную роль в регуляции биосинтеза антибиотиков [7]. Штамм 721 плазмид не содержит.

При культивировании штамма 628 в течение 24 ч как в глубинных, так и в поверхностных условиях, АС не определяется (рис. 1, а, кривая 1). Максимальное накопление АС в жидкой культуре происходит после 48 ч роста, содержание антибиотика увеличивается в культуре в процессе всего эксперимента, вплоть до 168 ч (рис. 1, кривая 1). На твердой среде максимальное образование АС наблюдается до 48 ч роста культуры, а к 168 ч содержание антибиотика несколько снижается (рис. 1, а, кривая 2). Такой же характер биосинтеза АС в разных условиях выращивания наблюдается и у штамма 721 (рис. 1, б, кривые 1, 2).

Рис. 1. Образование антибиотиков штаммами S.chrysomallus ВКМ Ас-628 и S.chrysomallus ВКМ Ас-721 в жидкой культуре и на агаризованной среде.
По оси абсцисс - возраст культуры, ч; по оси ординат: слева - содержание антибиотиков, мкг; справа - оптическая плотность, ед. Плотность посева: для штамма 628 - 8?107 ЖК, для штамма 721 - 3?107 ЖК. Кривая 1 - динамика накопления АС в жидкой среде; кривая 2 - накопление АС на агаризованной среде; кривая 3 - накопление МТЛ в жидкой среде; кривая 4 - накопление МТЛ на агаризованной среде; кривая 5 - динамика роста культур в жидкой среде. СМ - субстратный мицелий, ВМ- воздушный мицелий, Сп - спорогенез.

В 24-часовых жидких культурах штаммов 628 и 721 содержание нактиновых соединений очень незначительно (рис. 1, а, б, кривая 3). После 24 ч биосинтез МТЛ резко возрастает и остается на таком же уровне в 48 ч, 72 ч и 96 ч роста. К 168 ч содержание МТЛ в погруженных культурах снижается в тех случаях, когда происходит частичный лизис культуры, возможно в связи с гидролизом антибиотика.

При выращивании исходных штаммов 628 и 721 на плотной среде некоторый прирост МТЛ выявляется уже через 24 ч роста (рис. 1, а, б, кривые 4). К 48 ч биосинтез этих антибиотиков значительно увеличивается, а к 72 ч резко падает, снижаясь к 96-168 ч роста фактически до уровня 24 ч (рис. 1, а, б, кривые 4).

У штамма 590 в жидкой культуре биосинтез антибиотиков в процессе всего эксперимента, вплоть до 168 ч роста, остается очень низким (рис. 2, а, кривые 1, 3). В поверхностной культуре штамма 590 динамика биосинтеза АС и МТЛ аналогична предыдущим штаммам (рис. 2, а, кривые 2, 4), но уровень биосинтеза антибиотиков ниже, чем в других культурах.

При изучении bld мутантов штаммов 628 и 721 при культивировании как в жидкой, так и на агаризованных средах синтеза АС не наблюдалось. Динамика накопления МТЛ как поверхностными, так и погруженными культурами этих мутантов одинакова и схожа с результатами, полученными для родительских штаммов при выращивании последних в жидкой среде (рис. 3, а, б, кривые 1, 2). Однако, уровень биосинтеза МТЛ в погруженных культурах bld мутантов штаммов 628 и 721 существенно ниже, чем на твердой среде (рис. 3, а, б, кривые 1, 2).

Рис. 2. Накопление антибиотиков штаммом S.chrysomallus ВКМ Ас-590 и его bld мутантами в жидкой и поверхностной культуре.
По оси абсцисс - возраст культуры, ч; по оси ординат: слева - содержание антибиотиков, в мкг; справа - оптическая плотность, ед. Плотность посева: для штамма 590 - 2?107 ЖК, для штамма 590 Н1 - 2?107 ЖК, для штамма 590 НБ - 3?107 ЖК. Кривая 1 - динамика накопления АС в жидкой среде; кривая 2 - накопление АС на агаризованной среде; кривая 3 - накопление МТЛ в жидкой среде; кривая 4 - динамика накопления МТЛ на агаризованной среде; кривая 5 - динамика роста культур в жидкой среде. СМ - субстратный мицелий, ВМ - воздушный мицелий, Сп - спорогенез.

Рис. 3. Биосинтез антибиотиков bld мутантами штаммов S.chrysomallus ВКМ Ас-628 и S.chrysomallus ВКМ Ас-721 в жидкой и поверхностной культуре.
По оси абсцисс - возраст культуры, ч; по оси ординат: слева - содержание антибиотиков, мкг; справа - оптическая плотность, ед. Плотность посева: для штамма 628 Н1 - 107 ЖК, для штамма 721 Н1 - 3?107 ЖК. Кривая 1 - динамика накопления МТЛ в жидкой среде; кривая 2 - накопление МТЛ на агаризованной среде; кривая 3 - динамика роста культур в жидкой среде. СМ - субстратный мицелий.

Показано, что bld мутанты штамма 590 сохраняют способность синтезировать некоторое количество АС. Жидкие культуры этих мутантов также, как и родительские штамм, синтезируют антибиотики в существенно меньших количествах. На агаризованной среде биосинтез МТЛ сходен с таковым для bld мутантов других штаммов (рис. 2, б, в, кривые 2, 4).

Далее...


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования