Газохроматографическая экспресс-диагностика кандидоза и мониторинг эффективности противогрибковой терапии по уровню D-арабинитола и маннозы у детей

Московский детский центр лабораторной диагностики Детской городской клинической больницы N 13 им. Н.Ф. Филатова

В начало...

Результаты и обсуждение

Результаты, полученные при обследовании детей с различными заболеваниями, вызванными грибами рода Candida, для удобства изложения представлены поочередно для трех групп больных: с грибковыми осложнениями при онкогематологических заболеваниях, с грибковыми менингитами, с грибковыми поражениями мочевыделительной системы.

Таблица 1. Средние показатели содержания D-арабинитола и маннозы в сыворотке крови у детей с онкогематологическими заболеваниями и кандидозными осложнениями до и после противогрибковой терапии
Группа, число образцов	D-арабинитол, мкг/мл			Манноза, мкг/мл			Достоверность различий при сравнении с нормой и с группами I и II	Kоэффициент корреляции
	M m	M SD	M (медиана)	M m	M SD	M (медиана)
Сравнения (норма) n = 43	0,51 0,05	0,51 0,28	0,5	17,7 2,1	17,7 10,4	19,8
I (до лечения) n = 32	1,87 0,24	1,87 1,3	1,3	106,4 21,8	106,4 123,1	64,6	рА=0,000002 рМ=0,000671	rA-M=0,63
II (после лечения) n = 23	0,43 0,06	0,43 0,23	0,4	34,0 4,1	34,0 19,5	34,4	рAI-II=0,0002 pMI-II=0,0144	rA-M=0,33

Условные обозначения: А - D-арабинитол, М - манноза, А-М - сравнение D-арабинитола с маннозой.

Таблица 2. Средние показатели содержания D-арабинитола и маннозы в ликворе и сыворотке крови у детей с менингитами
Исследуемый материал	D-арабинитол,мкг/мл			Манноза, мкг/мл			Достоверность различий в сравнении с нормой	Kоэффициент корреляции
	M m	M SD	M (медиана)	M m	M SD	M (медиана)
Сыворотка крови (n = 11)	1,28 0,25	1,28 0,8	1,0	54,3 27,9	54,3 92,3	30,0	рА=0,03 рМ=0,43	rA-M=0,08 rM-M=0,66
Норма (n = 43)	0,51 0,05	0,51 0,28	0,5	17,7 2,1	17,7 10,4	19,8
Ликвор (n = 14)	15,7 2,5	15,7 9,5	13,9	91,4 21,0	91,4 78,7	70,5	рА=0,0058 рМ=0,029	rA-M=0,09 rA-A=0,75
Норма (n = 40)	7,24 0,56	7,24 3,04	7,35	67,1 8,7	67,1 47,4	52,7

Условные обозначения: А - D-арабинитол, М - манноза, А-М - сравнение D-арабинитола с маннозой, А-А и М-М - сравнение D-анабинитола и маннозы сыворотки крови и ликвора.

Таблица 3. Средние показатели содержания грибковых метаболитов в сыворотке крови у детей с кандидозом мочевыделительной системы
Исследуемый материал	D-арабинитол, мкг/мл			Манноза, мкг/мл			Достоверность различий в сравнении с нормой	Kоэффициент корреляции
	M m	M SD	M (медиана)	M m	M SD	M (медиана)
Сыворотка крови от больных (n = 8)	1,61 0,28 (норма 0,51 0,05)	1,61 0,78 (норма 0,51 0,3)	1,45 (норма 0,5)	95,3 49,4 (норма 17,7 2,1)	94,3 139,7 (норма 17,7 10,4)	54,0 (норма 19,8)	рА=0,011 рМ=0,19	rA-M=0,67
Норма (n = 43)	0,51 0,05	0,51 0,28	0,5	17,7 2,1	17,7 10,4	19,8

Условные обозначения: А - D-арабинитол, М - манноза, А-М - сравнение D-арабинитола с маннозой.

Пациенты с грибковыми осложнениями при онкогематологических заболеваниях на фоне цитостатической терапии и нейтропении. Из 32 детей с онкогематологическими заболеваниями, которым клинически был поставлен диагноз кандидоза и назначена системная противогрибковая терапия, при классическом микробиологическом исследовании грибы рода Candida были изолированы только у 25 (71,4%) больных. При посеве крови рост грибов получен лишь в 2 случаях, у остальных детей грибы рода Candida выделены в мазках со слизистых в концентрации от 10² до 10⁵ КОЕ/тампон как в монокультуре, так и в ассоциации. Наиболее часто обсеменена была слизистая ротоглотки.

При ГХ-исследовании крови уровень грибковых метаболитов был повышен у 31 (96,8%) ребенка. До начала противогрибковой терапии (см. табл. 1) уровень D-арабинитола составлял в среднем 1,87 0,24 мкг/мл (норма до 0,8 мкг/мл), уровень маннозы - 106,4 21,8 мкг/мл (норма до 30 мкг/мл). В целом, у всех детей, обследованных методом ГХ до начала противогрибковой терапии, уровни арабинитола и маннозы были достоверно выше нормы (p _А < 0,001, p_M < 0,001). Интересен тот факт, что корреляция между повышением маннозы и арабинитола была относительно высока (r = 0,63), хотя колебания уровня маннозы внутри группы оставались достаточно существенными (от 45 до 400 мкг/мл).

В процессе лечения амфотерицином В или флюконазолом уровень метаболитов существенно снижался (см. табл. 1), а после завершения курса противогрибковой терапии был сопоставим с нормальными показателями. Различия в уровнях арабинитола и маннозы до и после лечения достоверны, хотя у отдельных больных показатели маннозы снижались недостаточно быстро, оставаясь на относительно высоком уровне. Клиническая симптоматика и состояние пациентов, в целом, на фоне противогрибковой терапии имели положительную динамику.

Клинический пример. Девочка Д., возраст 3 года, поступила в отделение онкогематологии Республиканской Детской клинической больницы 26.03.93 г. с лихорадкой, увеличением лимфоузлов, печени, селезенки, изменениями в анализе крови. Поставлен диагноз: острый миелобластный лейкоз. Начата индуктивная фаза терапии по протоколу FML-BFM-90. С 31.03. по 7.04 получила курс цитозин-арабинозид, доксорубицин, этопозид. Период аплазии составил 20 дней (3.04-22.04.93). С 11.04 по 18.04 и с 20.04 по 21.04 лихорадка до 38,5?С и выше. Получала антибактериальную терапию: ципрофлоксацин, цефтазидим, амикацин, затем ванкомицин. Клинически отмечался тяжелый стоматит II-III степени; кашель, аускультативно в легких влажные хрипы. Со стороны желудочно-кишечного тракта отмечался жидкий стул с 13.04 по 19.04. Учитывая длительную лихорадку, отсутствие эффекта от антибактериальной терапии, клинически поставлен диагноз грибковой суперинфекции и с 3.04 назначен амфотерицин В в дозе 1 мг/кг/сутки внутривенно. Суммарная доза составила 12,5 мг/кг. Клинические симптомы разрешились к 23.04. Ребенок вышел из аплазии. Была достигнута ремиссия основного заболевания.

С 28.04 по 1.05 девочка получала высокие дозы цитозара с даунорубицином. Период аплазии составил 18 дней (5.05-23.05). В клинической картине отмечалась персистирующая лихорадка 2 дня, папулезная сыпь на коже с 4.05 по 6.05, одышка и влажные хрипы в легких с 13.05. Сыпь и лихорадка расценены как симптомы рецидива грибковой инфекции. При микробиологическом исследовании крови роста микрофлоры не было выявлено. При ГХ-исследовании 6.05 в сыворотке крови уровень D-арабинитола составил 2,8 мкг/мл, маннозы - 400 мкг/мл. Был назначен амфотерицин В через день в дозе 1 мг/кг, суммарная доза составила 15,6 мг/кг. D-арабинитол в сыворотке крови 18.05 снизился до нормы - 0,5 мкг/мл, манноза также существенно снизилась - до 48 мкг/мл. Из-за появления признаков нефротоксичности амфотерицина В (повышение АД и мочевины) позднее он был заменен на флюконазол (дифлюкан) и онкотил. Клиническое улучшение наступило 25.05. Выход из аплазии произошел 30.05.93 г. и был назначен курс консолидирующей терапии по протоколу AML-BFM-87. Во время данного курса уровень D-арабинитола не превышал норму и колебался от 0,5 до 0,6 мкг/мл, манноза - от 42,7 до 37,7 мкг/мл, клинических данных за инфекционный процесс не было. Ребенок выписан в удовлетворительном состоянии. После выздоровления рецидивов не было. В настоящее время грибковой инфекции нет, девочка здорова.

Особенностью данного случая были трудность клинической диагностики грибковой инфекции в условиях отсутствия положительных результатов культурального метода исследования. Назначенное по данным ГХ-исследования и проведенное под его контролем эмпирическое противогрибковое лечение оказалось эффективным.

Пациенты с грибковым менингитом. В группе детей из 14 человек, которым диагноз грибкового менингита был поставлен клинически (анамнез, предшествующая антибиотикотерапия, нейтрофильный цитоз в ликворе, воспалительные изменения в крови, инфекционный токсикоз, неврологическая симптоматика), лишь в 3 случаях получено культуральное подтверждение. Еще у 2 детей C.albicans была выделена из крови, у 3 - из мочи, у 2 C.albicans обнаружена на слизистых зева в высоких концентрациях (10⁴-10⁵/тампон). Все выделенные грибы были идентифицированы как C.albicans. У 5 детей грибы не высевались ни в одном из образцов клинического материала. Тем не менее назначенная на основании клинической симптоматики противогрибковая терапия оказалась эффективной у 13 из 14 детей. Один ребенок в возрасте 1 месяца погиб. При патологоанатомическом исследовании причина смерти - гнойный менингит, вызванный грибами рода Candida. Прижизненный посев ликвора роста не дал, а эмпирическая противогрибковая терапия флюконазолом в данном случае была начата слишком поздно, практически за 2 дня до летального исхода.

При ГХ-исследовании спинномозговой жидкости получены следующие результаты: у 13 (92,9%) детей D-арабинитол в ликворе был достоверно (р = 0,012) выше нормы и лишь у одного ребенка (7,1%) - на верхней границе нормы. В среднем уровень арабинитола у детей с клиническим диагнозом грибкового менингита составил 15,73 2,54 мкг/мл (в норме до 10,5 мкг/ мл). Уровень маннозы был подвержен большим колебаниям и не коррелировал с нарастанием арабинитола (r = 0,15). В среднем уровень маннозы составил 91,4 21,0 мкг/мл (см. табл. 2).

Различия уровней арабинитола в сыворотке крови у детей с клиникой грибкового менингита по сравнению с контрольной группой были также достоверны (р = 0,03), в отличие от маннозы (р = 0,43). Кроме того, была отмечена достаточно тесная корреляция (r = 0,75) между подъемом уровня арабинитола в ликворе и в сыворотке крови. Корреляция же между уровнем маннозы в ликворе и сыворотке крови была слабее (r = 0,66).

При назначении противогрибковой терапии (флюконазолом или амфотерицином В) клинически у 13 детей была отмечена положительная динамика, а показатели арабинитола в ликворе снижались до 8 мкг/мл, маннозы - до 19,2 мкг/ мл, в крови, соответственно, арабинитола - до 0,3 мкг/мл, маннозы - до 24-35 мкг/мл (см. табл. 2), включая тех 5 больных с клиникой менингита, у которых микробиологически грибы не были выделены ни в одном из образцов клинического материала. Ретроспективно полученные данные свидетельствуют в пользу правильного выбора эмпирической противогрибковой терапии в сложных случаях при подозрении на грибковую этиологию заболевания в условиях отсутствия микробиологического подтверждения.

У ребенка М., который погиб от кандидозного сепсиса, подтвержденного микробиологически (C.albicans), были выявлены крайне высокие титры метаболитов грибов (D-арабинитол - 48 мкг/мл, манноза - 107 мкг/мл), но материал на ГХ-анализ был прислан поздно, на 2-й неделе заболевания, и противогрибковая терапия успеха не имела.

Дети с кандидозом мочевыделительной системы. У всех 8 детей с кандидозом мочевыделительной системы микробиологически была обнаружена достаточно высокая (до 10⁵ КОЕ/мл и выше) кандидурия. У 7 пациентов выделенные грибы были идентифицированы как C.albicans, у 1 больного выделена из мочи C.tropicalis. Кандидемии не было отмечено ни в одном случае.

Данные ГХ-анализа показали: у всех детей арабинитол в сыворотке крови был достоверно (р = 0,011) выше нормы, лишь у 1 ребенка определялся на верхней границе нормы. В среднем, уровень D-арабинитола составил 1,61 0,28 мкг/ мл (M m) (см. табл. 3). Уровень маннозы был чрезвычайно вариабельным, в ряде случаев даже ниже показателей контрольной группы. В среднем уровень маннозы составил 95,3 49,4 мкг/ мл (M m) при среднем отклонении (SD) 139,7 мкг/мл. Различия уровней D-арабинитола в сыворотке крови при сравнении с контрольной группой сравнения были достоверны (р = 0,011), а для маннозы недостоверны (р = 0,19). В то же время интересно отметить, что уровень маннозы в каждой паре данных коррелировал с уровнем D-арабинитола (r = 0,67). Следовательно, принимая за основу ГХ-диагностики показатели уровня D-арабинитола, у больных данной группы можно учитывать и показатель уровня маннозы как дополнительного компонента.

При проведении противогрибковой терапии флюконазолом или амфотерицином В показатели арабинитола в сыворотке крови снижались до 0,5 мкг/мл, маннозы - до 20-34 мкг/мл. Клинически у больных отмечалась положительная динамика с последующим выздоровлением.

Далее...