Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://www.enzyme.chem.msu.ru/eduproc/prac/task9/part11.doc Дата изменения: Fri Feb 13 19:30:52 2004 Дата индексирования: Mon Oct 1 23:25:32 2012 Кодировка: koi8-r Поисковые слова: флуоресценция

ГЛАВА11.
Флуоресценция белков
Опубликованы обширные данные по флуоресценции белков и пептидов. Это
связано с тем, что такие природные флуорофоры, как тирозин и триптофан,
присутствуют практически во всех белках. Флуоресценция большинства белков
вызывается в первую очередь триптофановыми остатками, индольные кольца
которых - уникально чувствительные и сложные флуорофоры. Индол, триптофан и
их производные очень чувствительны к полярности растворителя и подвержены
как общим, так и специфическим взаимодействиям с растворителем, благодаря
чему спектр испускания триптофановых остатков может отражать полярность их
ближайшего окружения. На спектры испускания белков влияют связывание
субстратов, реакции ассоциации и денатурации. Измерение поляризации
отражает усредненное время релаксации триптофановых остатков, несмотря на
экспериментальные трудности, вызываемые сложностью их поляризационного
спектра. Следовательно, путем измерения поляризации можно выявлять влияние
денатурантов на структуру белка, реакции ассоциации белков с лигандами и
другими макромолекулами. И наконец, триптофан оказывается уникально
чувствительным к тушению различными веществами. В дополнение к тушению
кислородом и иодид-ионами триптофан тушится такими веществами, как
акриламид, сукцинимид, пероксид водорода, дихлорацетамид,
пиридингидрохлорид, цистеин, хлорированные углеводороды, N03-, I03- , Cs+,
Си2+, РЬ2+, Cd2+ и Mn2+. Эта чувствительность к различного рода тушителям
обусловлена склонностью возбужденного индольного ядра донировать электроны
во время нахождения в возбужденном состоянии. Чувствительность к тушителям
позволяет определять доступность триптофановых остатков в белках методом
тушения.
Детальный анализ флуоресценции белков затрудняется как обилием
факторов, которые влияют на флуоресценцию индольной составляющей, так и
наличием в большинстве белков нескольких разных триптофановых остатков. Так
как каждый остаток находится в разном окружении, то и спектральные свойства
каждого остатка в общем случае различаются. Испускания всех остатков
перекрываются во всем используемом диапазоне длин волн, и довольно сложно
разделить спектральные вклады каждого из них в многотриптофановом белке.
Кроме того, спектры испускания и кинетика затухания интенсивности
флуоресценции довольно сложны, как было найдено даже для свободного
триптофана и для белков, содержащих единственный триптофановый остаток.
Например, для большинства белков с единственным триптофановым остатком не
наблюдается единственного времени затухания флуоресценции. По этой причине
нельзя просто интерпретировать многоэкспоненциальную кинетику затухания в
терминах поведения индивидуальных остатков в многотриптофановых белках. В
данной главе дается общий обзор флуоресценции белков. Детальный обзор
данных по флуоресценции аминокислот и белков был сделан несколькими
авторами, и более подробную информацию можно найти в работах [3-5].

11.1. Спектральные свойства ароматических аминокислот
Белки содержат три аминокислотных остатка, которые могут давать вклад
в ультрафиолетовую флуоресценцию: тирозин (Туг), триптофан (Тгр) и
фенилаланин (Phe). Спектры поглощения этих аминокислот приведены на рис.
11.1. Флуоресценция белков обычно возбуждается в максимуме поглощения при
280 нм или больших длинах волн. Следовательно, фенилаланин не возбуждается
в большинстве экспериментальных случаев. Более того, квантовый выход
фенилаланина в белках мал, так что испускание этого остатка наблюдается
редко.
[pic]
РИС. 11.1. Спектры поглощения ароматических аминокислот.

Поглощение белков при 283 нм связано с тирозиновыми и триптофановыми
остатками. При длинах волн > 295 нм поглощает главным образом триптофан.
Поэтому предполагается, что его флуоресценция может быть селективно
возбуждена в диапазоне 295 - 305 нм, что и было доказано экспериментально.
Однако в следующем разделе мы опишем особенности флуоресценции тирозината
при таком длинноволновом возбуждении.
Флуоресцентные спектры испускания ароматических аминокислот приведены
на рис. 11.2. Испускание тирозина в воде происходит при 303 нм и
сравнительно нечувствительно к полярности растворителя. Максимум испускания
триптофана в воде находится при 348 нм и сильно зависит от полярности.
Несколько различающиеся максимумы испускания могут быть получены на
различных приборах в зависимости от спектральных характеристик
индивидуальных оптических компонент. Важно отметить, что тирозиновые
остатки могут претерпевать ионизацию в возбужденном состоянии, приводящую к
потере протона ароматической гидроксильной группой. В основном состоянии
для этого гидроксила рК(10, а в возбужденном состоянии рК уменьшается до~4.
Гидроксильная группа может диссоциировать в течение времени жизни
возбужденного состояния, что приводит к тушению флуоресценции тирозина.
Ранее полагали, что тирозинат не флуоресцирует, но выяснилось, что он слабо
флуоресцирует при 345нм (разд. 11.3.3).
[pic]
РИС. 11.2 Флуоресцентные спектры испускания ароматических аминокислот.

11.1.1. Поляризационные спектры возбуждения тирозина и триптофана
Поляризационные спектры возбуждения для тирозина и триптофана заметно
различаются. Поляризационный спектр возбуждения тирозина приведен на рис.
11.3. Область относительно постоянной анизотропии наблюдается при 280 - 290
нм, что указывает на преобладающий вклад единственного электронного
перехода в области длинноволновой полосы поглощения. При более
коротковолновом возбуждении анизотропия монотонно уменьшается до минимума
при 235 нм, который связывают со вторым электронным переходом. В
противоположность тирозину триптофан (рис. 11.4) не имеет постоянной
поляризации в области длинноволновой полосы поглощения. Высокое значение r0
при возбуждении на 300 нм указывает на приблизительную параллельность
диполей поглощения и испускания. Анизотропия уменьшается до минимума при
290 нм и увеличивается при длинах волн 280 - 260 нм. Такое сложное
поведение приписывается присутствию двух электронных уровней (1La и 1Lb) в
последней длинноволновой полосе поглощения триптофана. Наличие двух
возбужденных состояний с приблизительно одинаковой энергией привело к
значительному числу исследований и дискуссий о том, какое из состояний
отвечает за испускание флуоресценции. Это разногласие полностью не
устранено и сейчас, но, по-видимому, в большинстве случаев испускание
белков не структурировано из-за состояния 1La . Существование минимума r0
при 290 нм связывают с переходом 1Lb, диполь испускания которого
приблизительно перпендикулярен переходу 1La и диполю перехода,
ответственного за испускание (также 1La).
[pic]
РИС. 11.3. Спектр поляризации флуоресценции тирозина в пропиленгликоле при
-70 єС
[pic]
РИС. 11.4. Спектр поляризации флуоресценции триптофана в пропипенгликоле
при -70 њС.


11.1.2. Влияние растворителя на спектры испускания производных
триптофана
На флуоресцентный спектр испускания триптофана влияют как
специфические, так и общие взаимодействия с растворителем. Это иллюстрирует
рис. 11.5, на котором приведено влияние бутанола на спектр испускания
индола в гексане. В чистом гексане наблюдается структурированный спектр
испускания, который является зеркальным отражением перехода 1La индола.
Добавление следовых количеств полярного растворителя н-бутанола приводит к
тушению такого структурированного спектра, сопровождаемому появлением
бесструктурного длинноволнового спектра испускания, являющегося зеркальным
отражением перехода 1La индола Эти результаты указывают на двойное
испускание из состояний 1La и 1Lb, причем на переход 1La растворитель
влияет более сильно, чем на переход 1Lb, и энергия перехода 1La понижается
в полярных растворителях. Большая чувствительность состояния 1La к
растворителю кажется вполне обоснованной, так как в переход 1La
непосредственно вовлечен атом азота индола (см. разд. 5.3.1). Однако, как
отмечалось, потеря структуры в спектре испускания может быть связана не с
двойным испусканием из состояний 1La и 1Lb, а со специфическим влиянием
растворителя на отдельный электронный переход.
[pic]
РИС. 11.5. Флуоресцентный спектр ;пускания индола. 1 - спектр испускания в
гексане; 2 - в гексане, содержащем 0,7% н-бутанола; 3 - в гексане с 5% н-
бутанола; 4 - в 100%-ном бутаноле, 5 - в воде.

Различная чувствительность состояний 1La и 1Lb к растворителю
иллюстрируется спектрами поглощения производных триптофана, приведенными на
рис. 11.6. Напомним, что структурированные пики в поглощении обусловлены
состоянием 1Lb. Добавление 2,5% бутанола приводит к уширению спектра и
увеличению поглощения при длинах волн > 290 нм. Полагают, что этот эффект
связан с длинноволновым сдвигом бесструктурного перехода 1La при
взаимодействии с полярной составляющей. Переход 1Lb менее чувствителен к
полярности растворителя и поэтому не сдвигается в длинноволновую область.
Эти результаты согласуются со спектрами испускания. Интенсивность
структурированного испускания уменьшается, но сдвиг в присутствии бутанола
не происходит (рис. 11.5). В дополнение к этому специфическому эффекту
растворителя наблюдается чувствительность индольного кольца к полярности
растворителя, на что указывает дальнейший сдвиг испускания в длинноволновую
область по мере увеличения концентрации бутанола до 100% (рис. 11.5).
Подобные результаты были получены также в работах [11,12], т.е.
первоначальная потеря структурированного испускания при низких
концентрациях полярной составляющей сменяется дальнейшим сдвигом в
длинноволновую область при высоких концентрациях спирта. Авторы указанных
работ объясняют сдвиг спектра образованием специфического комплекса между
спиртом и производным индола. Образование комплекса кажется очень
вероятным, но их точная стехиометрия вызывает сомнения. В любом случае
ясно, что для интерпретации флуоресценции белков требуется рассмотрение и
специфического, и общего влияния растворителя на триптофановые остатки.
[pic]
РИС. 11.6. Спектры поглощения некоторых производных триптофана. 1, 2 - н-
гексилового эфира N-стеароил-L-триптофана; 3, 4 - 3-метилиндола. Спектры 1
и 3 сняты в метилциклогексане; 2 и 4 - после добавления 2,5% н-бутанола.

11.2. Общая характеристика флуоресценции белков

11.2.1. Испускание тирозина и триптофана
При возбуждении на 280 нм в испускании большинства нативных белков
преобладает флуоресценция триптофана. Это иллюстрирует рис. 11.7, на
котором приведен спектр человеческого сывороточного альбумина (HSA), а
также спектр испускания триптофана и смеси тирозина с триптофаном в
молярном соотношении 18:1. Испускание триптофана находится в области более
коротких длин волн по сравнению с испусканием триптофана в воде.
Коротковолновый сдвиг является результатом экранирования триптофановых
остатков от воды белковой матрицей. Несмотря на относительно большое число
тирозиновых остатков, спектр испускания HSA, по-видимому, - спектр главным
образом триптофана. Что кажется неожиданным, поскольку испускание тирозинов
преобладает в указанной смеси тирозина с триптофаном в соответствии с
пропорцией этих остатков в HSA. В противоположность сильному поглощению при
280 нм и высокому квантовому выходу в водных растворах испускание
триптофана в большинстве белков слабое и часто недетектируемое. Отсутствие
тирозинового испускания у большинства белков зависит от трехмерной
структуры. Денатурация белков приводит к увеличению испускания тирозинов,
но их вклад обычно меньше, чем найденный для эквимолярных смесей.
[pic]
РИС. 11.7. Флуоресцентный спектр испускания человеческого сывороточного
альбумина и ароматических аминокислот.
1 - спектры испускания HSA, 2 - триптофана; 3 - смеси тирозина и
триптофана, эквивалентной той, которая найдена для HSA.

В связи с отсутствием тирозиновой флуоресценции в белках был высказан
ряд соображений, в том числе относительно переноса энергии на триптофановые
остатки и тушения близлежащими группами полипептидной цепи. Следует
ожидать, что перенос энергии (гл. 10) будет эффективен, так как
фёрстеровский радиус для переноса тирозин - триптофан составляет 14 е, и
это расстояние сравнимо с диаметром большинства белков. Однако перенос
энергии не главная причина отсутствия у HSA флуоресценции тирозина.
Единственный триптофановый остаток HSА может быть разрушен фотоокислением
или удален путем ферментативного расщепления. Если бы перенос энергии был
главной причиной отсутствия заметной флуоресценции тирозина, то отсутствие
акцептора привело бы к увеличению испускания тирозиновых остатков. Такого
увеличения испускания не наблюдается, следовательно, перенос энергии на
триптофановый остаток не единственная причина тушения флуоресценции
тирозина.
Бесспорно, что потеря тирозиновой флуоресценции белками определяется
рядом факторов. Флуоресценция тирозина может быть потушена близко
расположенными карбоксильными группами или незаряженными аминогруппами.
Такое тушение связано с переносом протона на эти акцепторы протонов в
течение времени жизни возбужденного состояния, что было доказано при
изучении флуоресценции сополимеров тирозин-глутамат и тирозин-лизин. Кроме
того, флуоресценция тирозина тушится также заряженными аминогруппами и
нейтральными карбоксильными группами. Механизм тушения может включать
перенос протона от фенола либо в основном, либо в возбужденном состоянии.
Образование пептидной связи карбоксильной группой или аминогруппой тирозина
еще больше понижает его квантовый выход. В белках гидроксильная группа
может образовывать водородную связь с пептидной связью, а связанные
водородной связью фенолы не флуоресцируют. Следовательно, флуоресценция
тирозина может отсутствовать или быть минимальной в белках по разным
причинам. Для любого индивидуального белка точный механизм тушения
тирозиновой флуоресценции не известен.
Хотя флуоресценция тирозина обычно слаба и нечувствительна к
растворителям, часто бывает необходимо полностью исключать такой
дополнительный источник гетерогенности во флуоресценции белков. Обычно это
достигается путем возбуждения при 295 нм, где поглощение тирозина (но не
тирозината, разд. 11.3.3) минимально. Примером может служить пептидный
гормон адренокортикотропина (АСТН, рис. 11.8). АСТН содержит тирозиновые
остатки в положениях 2 и 23 и единственный остаток триптофана в положении
9. При возбуждении на 275 нм наблюдается испускание и тирозина, и
триптофана. При возбуждении на 295 нм наблюдается только испускание
триптофана, поэтому такое возбуждение полезно выбирать в тех случаях, когда
желательно исключить испускание, связанное с тирозином.
В рассматриваемом примере небольшие размеры и доступность фрагментов
АСТН позволяют определить относительные квантовые выходы тирозиновых
остатков. Флуоресценция фрагмента, содержащего Туг-23 [АСТН (4-24)],
приблизительно эквивалентна флуоресценции целой молекулы. В
противоположность этому тирозиновая флуоресценция фрагмента АСТН,
содержащего только Туг-2 [АСТH (1-16)], значительно меньше, чем целой
молекулы АСТН. Таким образом. Туг- 23 имеет значительно больший квантовый
выход, чем Туг-2. Более низкий выход Туг-2 связывают с переносом энергии на
Тгр-9, который в аминокислотной последовательности расположен недалеко.
[pic]
РИС. 11.8. Графики, иллюстрирующие влияние длины волны возбуждения на
спектр испускания адренокортикотропина и его фрагментов.
Числа соответствуют номерам аминокислот АСТН (1 - 24), составляющих
фрагмент.


11.2.2. Перенос энергии от тирозина к триптофану
Определение эффективности переноса энергии от тирозиновых к
триптофановым остаткам в белках было предметом значительного числа
исследований и дискуссий. Интерес был отчасти вызван желанием понять
причину низкого квантового выхода флуоресценции тирозина в белках. Как было
описано ранее, денатурация белков приводит к увеличению интенсивности
флуоресценции тирозина, поэтому наблюдаемая интенсивность флуоресценции
тирозинов в белках и пептидах обычно меньше, чем для эквимолярных смесей
тирозиновых и триптофановых мономеров. Одним из возможных объяснений
низкого квантового выхода тирозина может быть эффективный перенос энергии
от тирозиновых к триптофановым остаткам. Если это верно, то можно было бы
использовать известную зависимость переноса энергии от расстояния для того,
чтобы определять расстояния тирозин-триптофан в белках. Диаметры белков
обычно сравнимы с критическим расстоянием переноса (10-18 е) для данной
донорно-акцепторной пары.
Анализ тирозин-триптофанового переноса энергии труден, поскольку
квантовые выходы тирозина низки. К тому же триптофан поглощает свет при
всех длинах волн, при которых поглощает тирозин. Следовательно, прямое
возбуждение флуоресценции триптофана всегда сопровождается возбуждением
тирозиновых остатков, и просто невозможно увидеть только флуоресценцию
триптофана, сенсибилизированную возбуждением остатков тирозина.
Для того чтобы обойти эти трудности, Эйзингер предложил исследовать
спектры возбуждения белков. Если не описывать существенные детали, то эта
методика может показаться несложной. В основе лежат следующие принципы.
Рассмотрим раствор, содержащий и тирозин, и триптофан. Используя известные
спектры поглощения индивидуальных остатков, можно вычислить долю поглощения
триптофановых остатков при каждой длине волны. Если не происходит переноса
энергии от тирозиновых остатков к триптофановым, то относительный квантовый
выход триптофана, скорректированный на общее поглощение раствора,
пропорционален доле поглощения триптофана. Если эффективность переноса
энергии 100%, то весь поглощенный свет проявится в виде флуоресценции
триптофана и квантовый выход триптофана не будет зависеть от длины волны
возбуждения, а только от общего количества света, поглощенного раствором.
Эта концепция представлена в количественном виде на рис. 11.9 для
эквимолярной смеси тирозина и триптофана (кривые 1) и для смеси в
соотношении 2:1 (кривые 2). Верхняя кривая 1 отражает долю общего
количества света, поглощенную триптофаном, которая определяется выражением
[pic] (11.1)


где [pic]i (?) - поглощение индивидуальных остатков при длине волны ?. Для
простоты в этом выражении опущена малая составляющая, обусловленная
поглощением фенилаланина. На рис. 11.9 можно видеть, что чисто
триптофановым является только поглощение с длинами волн > 295 нм. Это может
служить основой для использования этой длины волны для селективного
возбуждения триптофановой флуоресценции. Относительный квантовый выход при
возбуждении на длине волны 295 нм выбран в качестве эталонной точки, в
которой весь свет поглощается триптофаном. Флуоресценцию записывали при 350
нм или больших длинах волн. При таких длинах волн какой бы то ни было вклад
флуоресценции тирозина, по-видимому, должен быть минимальным. Относительный
квантовый выход ?(?) при любой длине волны можно вычислить по уравнению

[pic] (11.2)

где t - эффективность переноса энергии. Если t = 100%, то
относительный квантовый выход флуоресценции триптофана не зависит от длины
волны возбуждения. Если t = 0, то

[pic]
РИС. 11.9. Парциальное поглощение тирозина, триптофана и фенилаланина в
смеси аминокислот.
1 - молярное отношение Туг: Тгр: Phe = 1 :1 : 1; 2 - 2:1:1.


?(?) определяется парциальным поглощением триптофана. Точные
вычисления относительных квантовых выходов затруднены из-за необходимости
корректировки на изменение поглощения раствора. Характерные данные для
дипептида Туг-Тгр и для эквимолярной смеси тирозина и триптофана приведены
на рис. 11.10. В дипептиде (кривая 1) донор и акцептор находятся внутри
фёрстеровского радиуса, и эффективность переноса должна быть ~100%. Это
подтверждается независимостью квантового выхода триптофана от длины волны
возбуждения. Вся поглощенная раствором энергия независимо от того,
поглощается ли свет тирозином или триптофаном, проявляется как
флуоресценция триптофана. Для смеси (кривая 2) относительный квантовый
выход практически совпадает с долей поглощения триптофана, что указывает на
отсутствие заметного переноса энергии.
Путем сопоставления сравнимых данных для белков можно установить
эффективность тирозин-триптофанового переноса энергии. Данные для дрожжевой
алкогольдегидрогеназы (ADH) приведены на рис. 11.11. ADH содержит 6
триптофановых и 14 тирозиновых остатков. В нативном состоянии относительный
квантовый выход хорошо описывается теоретической кривой для эффективности
переноса 69%. Для ADH, денатурированной гуанидингидрохлоридом,
эффективность переноса понижается до нуля. Следовательно, на эффективность
тирозин-триптофанового переноса энергии влияет трехмерная структура белка.
Для ряда из восьми нативных белков было найдено, что эффективность переноса
энергии варьирует от 0,17 до 0,69, и все эти значения уменьшаются при
денатурации.

[pic]
РИС. 11.10. Зависимость относительного квантового выхода флуоресценции
дипептида триптофанилтирозина (1) и эквимолярной смеси тирозина и
триптофана (2) от длины волны возбуждения.
Линии соответствуют 100%-ной эффективности переноса энергии (Е = 1) и
отсутствию переноса энергии (Е = 0).

[pic]
РИС. 11.11. Зависимость квантового выхода флуоресценции триптофана
алкогольдегидрогеназы от длины волны.
а - для нативной ADH; б- для денатурированной 6 М гуанидингидрохлоридом.
Точками отмечены экспериментальные данные; сплошные линии - теоретические
кривые для установленной эффективности переноса энергии; штриховая линия -
теоретическая кривая для эффективности переноса 0%.

Для полноты обсуждения отметим, что существуют значительные
расхождения в оценке степени переноса энергии в белках. Например,
опубликованные эффективности переноса находятся в диапазоне от 0 до 100%.
Эти расхождения, по-видимому, связаны с трудностями измерения относительных
квантовых выходов при различных длинах волн возбуждения и, возможно, с
погрешностью fTrp, вызываемой сдвигом спектров поглощения тирозина и
триптофана в белках по сравнению со спектрами индивидуальных остатков в
водных растворах. Приведенные выше результаты, вероятно, указывают на то,
что степень переноса энергии сильно варьирует среди белков, и дополнительно
иллюстрируют, как относительные квантовые выходы могут быть использованы
для изучения переноса энергии при одновременном возбуждении донора и
акцептора.