Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://www.enzyme.chem.msu.ru/eduproc/prac/task9/part09.doc Дата изменения: Fri Feb 13 20:44:52 2004 Дата индексирования: Mon Oct 1 23:24:58 2012 Кодировка: koi8-r Поисковые слова: флуоресценция

ГЛАВА9.

Тушение флуоресценции


Тушением флуоресценции называют любые процессы, которые уменьшают
интенсивность флуоресценции данного вещества. К тушению может проводить
множество процессов, в том числе реакции в возбужденном состоянии, перенос
энергии, образование комплексов и тушение при столкновениях. Эта глава
посвящена главным образом тушению, связанному со случайными столкновениями
между флуорофором и тушителем, которое называется динамическим, или
тушением при столкновениях. Мы также рассмотрим статическое тушение,
которое связано с образованием комплекса. Статическое тушение часто
является осложняющим фактором в анализе динамического тушения. В дополнение
к процессам, упомянутым выше, может встречаться кажущееся тушение
вследствие оптических свойств образца. Например, высокая оптическая
плотность или мутность могут приводить к уменьшению интенсивности
флуоресценции. Это тривиальный тип тушения, который несет мало информации о
молекулярных процессах. В данной главе предполагается, что не эти
тривиальные эффекты определяют наблюдаемые изменения интенсивности
флуоресценции.
Тушение флуоресценции широко изучено как в теоретическом аспекте, так
и в приложении флуоресценции к биохимическим проблемам, причем приложения
связаны со свойствами процесса тушения. Для тушения (и статического, и
динамического) требуется контакт между молекулами флуорофора и тушителя. В
случае динамического тушения тушитель должен диффундировать к флуорофору в
течение времени нахождения в возбужденном состоянии. В результате контакта
флуорофор возвращается в основное состояние без излучения фотона. В случае
статического тушения между флуорофором и тушителем* образуется комплекс,
который не флуоресцирует. В любом случае, чтобы произошло тушение,
флуорофор и тушитель должны контактировать. Это - основное требование,
которое проявляется в различных приложениях тушения. Например, измерением
тушения можно выявить доступность флуорофоров для тушителей. Если данный
растворитель очень вязок, то диффузия замедляется и тушение ослабевает.
Следовательно, изучив тушение, можно определить скорости диффузии
тушителей. Предположим, флуорофор связан либо с белком, либо с мембраной.
Если белок или мембрана непроницаемы для тушителя и флуорофор локализован
внутри макромолекулы, то не может быть ни динамического, ни статического
тушения. Исходя из этих соображений, тушение можно использовать для
выяснения локализации флуорофоров в белках и мембранах и их проницаемости
для тушителей.
*В основном состоянии, до поглощения возбуждающего флуоресценцию
фотона.
Прим. ред
Другой важный аспект динамического тушения - увеличение объемов и
расстояний в растворе, влияющих на экспериментальные данные, которыми
являются интенсивность или время затухания флуоресценции.
Среднеквадратичное смещение (?х2)1/2, на которое тушитель может
продиффундировать за время жизни возбужденного состояния ?, составляет
(?х2) = 2D?, где D - коэффициент диффузии. Рассмотрим молекулу кислорода в
воде при 25њС (D = 2,5 . 10-5 см2/с). В течение типичного времени
затухания флуоресценции (4 нс) молекула кислорода может продиффундировать
на 44 е. Если время затухания длительнее, может наблюдаться диффузия на еще
большие расстояния. Например, для времен затухания 20 и 100 не средние
расстояния диффузии кислорода составляют 100 и 224 е соответственно. Так
как одного диффузионного столкновения с кислородом достаточно для тушения
большинства флуорофоров, измерение тушения флуоресценции выявляет диффузию
тушителей на сравнительно больших расстояниях. Эту ситуацию можно
сопоставить с релаксацией растворителя. Спектральные сдвиги, связанные с
переориентацией молекул растворителя, определяются главным образом
сольватной оболочкой, непосредственно соседствующей с флуорофором.

9.1. Тушители флуоресценции
Изучению тушения благоприятствует то, что многие вещества действуют
как тушители флуоресценции. Один из наиболее известных динамических
тушителей - молекулярный кислород [1], который тушит флуоресценцию почти
всех известных флуорофоров. Чтобы получить достоверные значения квантовых
выходов или времен затухания флуоресценции, для многих образцов часто
бывает необходимо удалить растворенный кислород. Механизм, по которому
кислород тушит флуоресценцию, был предметом многочисленных исследований, и
в настоящее время ясно, что для тушения необходим контакт между молекулами
кислорода и флуорофора. Ароматические и алифатические амины - эффективные
тушители для флуоресценции большинства незамещенных ароматических
углеводородов [2]. Например, флуоресценция антрацена эффективно тушится
диэтиланилином. В этом случае тушение происходит за счет образования
комплекса с переносом заряда*. Флуорофор в возбужденном состоянии
акцептирует электроны амина. В неполярных растворителях часто наблюдается
флуоресценция комплекса с переносом заряда (эксиплекса), и этот процесс
можно рассматривать как реакцию в возбужденном состоянии, а не как тушение.
В полярных растворителях излучение эксиплекса обычно потушено, так что
взаимодействие флуорофор - амин проявляется как истинное тушение. Другие
диффузионные тушители: ксенон [3], пероксид водорода [4], акриламид [5],
ВгО -4 [6], I-[7], оксид диазота, нитрометан [8], нитроксиды [9, 10].
Тушителями являются даже некоторые олефины [11 - 13] и стерически
затрудненные насыщенные углеводороды [14], Например, ?-цианонафталин
тушится некоторыми олефинами. В дополнение к вышеперечисленным соединениям
в качестве диффузионных тушителей можно назвать многие галогенсодержащие
вещества: хлороформ, трихлорэтанол [15], бромбензол [16], хлорид метилртути
[17] и различные соединения, содержащие более одного атома хлора [18].
Тушение тяжелыми галогенами, такими, как бромид и иодид, может быть
результатом интеркомбинационной конверсии в триплетное состояние,
ускоряющейся за счет спин-орбитального взаимодействия возбужденного в
синглетном состоянии флуорофора и галогена [19 ]. Так как испускание из
триплетного состояния медленное, то оно сильно тушится другими процессами.
Однако для хлорсодержащих веществ механизм тушения, вероятно, другой.
Индол, карбазол и их производные уникально чувствительны к тушению
хлорированными углеводородами [18] и акцепторами электронов, такими, как
протоны, гистидин, цистеин, NО3-, фумарат, Cu2+, Pb2+, Cd2+ и Мn2+ [20].
Тушение этими веществами, вероятно, включает перенос электрона от
флуорофора на тушитель. Кроме этого, индол, триптофан и их производные
тушатся сукцинимидом, дихлорацетамидом, гидрохлоридами пиридина и
имидазола, метионином, Eu3+, Ag+ и Cs+ [21]. Следовательно, множество
тушителей пригодно для изучения флуоресценции белков, в особенности при
рассмотрении поверхностной доступности триптофановых остатков и
проницаемости белков для тушителей.
Тушителями могут быть также пурины, пиримидины [22, 23], N-
метилникотинамиды и N-алкилпиридиниевые и пиколиниевые соли [24, 25].
Например, флуоресценция флавинадениндинуклеотида (FAD) и восстановленного
никотинамидадениндинуклеотида (NADH) тушится адениновой частью молекулы.
Тушение флуоресценции флавина происходит вследствие как статических, так и
динамических процессов, в то время как тушение дигидроникотинамида является
в основном динамическим. Эти ароматические соединения проявляют
______________________________________
* В возбужденном электронном состоянии.
. Прим. ред.
______________________________________
склонность к образованию комплексов с переносом заряда, что и вызывает
тушение флуоресценции. В зависимости от точной структуры изучаемых
соединений внутримолекулярный комплекс в основном состоянии может быть
достаточно устойчивым. Вследствие этого в FAD и NADH часто наблюдается и
динамическое, и статическое тушение.
Из-за того, что многие вещества могут действовать как тушители, часто
можно легко подобрать комбинацию флуорофор - тушитель для решения
поставленной задачи. Важно отметить, что не все флуорофоры тушатся любыми
перечисленными выше веществами. Этот факт иногда можно использовать для
селективного тушения определенного флуорофора. Эффект тушения зависит от
его механизма, обусловленного структурой индивидуальных молекул. Детальный
анализ механизма тушения сложен. В этой главе мы займемся главным образом
природой явления, т.е. выяснением того, является ли природа тушения
динамической или статической. В последней части главы будет приведено
несколько наиболее информативных биохимических приложений эффекта тушения.

9.2. Теория динамического тушения
Динамическое тушение флуоресценции описывается уравнением Штерна -
Фольмера:
(9.1)

где F0 и F - интенсивности флуоресценции в отсутствие и в
присутствии тушителя соответственно; kq - биомолекулярная константа
скорости тушения; ?0 - время затухания флуоресценции в отсутствие тушителя;
[Q] - концентрация тушителя; Кдин = kq ?0 - штерн-фольмеровская константа
тушения. Данные по тушению обычно представляют в координатах F0/F от [Q],
поскольку F0 /F, как ожидается, должно линейно зависеть от концентрации
тушителя. График дает, отсекаемый отрезок на оси у, равный единице, и
наклон, равный Кдин (рис. 9.1). Полезно отметить, что Кдин-1 равна
концентрации тушителя, при которой F0/F = 2, т.е. тушится 50% интенсивности
флуоресценции. Прямолинейная зависимость в координатах Штерна - Фольмера
обычно указывает на существование в растворе одного типа флуорофоров,
одинаково доступных для тушителя. Если присутствуют два типа флуорофоров и
один из них недоступен для тушителя, то штерн-фольмеровский график
отклоняется от линейности в сторону оси х. Такой результат часто
встречается при тушении флуоресценции триптофана в белках полярными или
заряженными тушителями. Эти молекулы с трудом проникают внутрь гидрофобных
белков и тушат только остатки триптофана на поверхности белка.
[pic]
РИС. 9.1. Сопоставление динамического и статического тушения.

Важно знать, что линейность, наблюдаемая в координатах Штерна -
Фольмера, еще не доказывает, что происходит динамическое тушение
флуоресценции. В последующих разделах (разд. 9.3) будет показано, что
статическое тушение также дает прямую линию в координатах Штерна -
Фольмера. В общем случае различить статическое и динамическое тушение можно
по их зависимости от температуры и вязкости или, что более предпочтительно,
по измерению времени затухания флуоресценции.

9.2.1. Вывод уравнения Штерна - Фольмера
Уравнение Штерна - Фольмера может быть выведено несколькими способами.
Прежде всего рассмотрим интенсивность флуоресценции в отсутствие и в
присутствии тушителя. Интенсивность флуоресценции, наблюдаемая для
флуорофора, пропорциональна его концентрации в возбужденном состоянии F*.
При непрерывном облучении устанавливается стационарная концентрация
возбужденных флуорофоров и, следовательно, d[F*] /dt = 0. В отсутствие и в
присутствии тушителя дифференциальные уравнения, описывающие F*
представляются в виде
(9.2)
(9.3)
где f(t) - постоянная функция возбуждения флуоресценции, которая легко
исключается из этих уравнений. Г = ?0-1 представляет собой константу
скорости дезактивации флуорофора в отсутствие тушителя. Из уравнений (9.2)
и (9.3) получаем уравнение Штерна - Фольмера

(9.4)

Это уравнение может быть также выведено путем рассмотрения доли
возбужденных флуорофоров, дезактивирующихся путем излучения, по отношению к
общему числу возбужденных флуорофоров. Доля F0/F определяется отношением
скорости затухания Г флуоресценции к общей скорости затухания в присутствии
тушителя (Г+kq[Q]):

(9.5)

Это выражение также является уравнением Штерна - Фольмера. Так как
динамическое тушение - конкурирующий процесс, который дезактивирует
возбужденное состояние, время затухания в отсутствие (? 0) и в присутствии
(?) тушителя дается выражениями

(9.6), (9.7)
(9.8)

Последний вывод иллюстрирует важную характеристику динамического
тушения, которая состоит в одинаковом уменьшении интенсивности и времени
затухания флуоресценции (рис. 9.1):

(9.9)

Уменьшение времени затухания происходит из-за того, что тушение
представляет собой дополнительный конкурирующий процесс, дезактивирующий
возбужденное состояние без испускания флуоресценции, что ведет к уменьшению
квантового выхода. Благодаря этим ценным свойствам тушение при
столкновениях используют для контроля времени затухания с последующим
определением природы наносекундной кинетики затухания анизотропии (разд.
6.4) или временной зависимости релаксации растворителя (разд. 8.5).

9.2.2. Интерпретация бимолекупярной константы скорости тушения
Частота столкновений флуорофора с тушителем дается выражением

(9.10)

где k0 - диффузионно-контролируемая бимолекулярная константа скорости,
которая может быть вычислена по уравнению Смолуховского:

(9.11)

где R - радиус столкновения; D - сумма коэффициентов диффузии
флуорофора (Df) и тушителя (Dq); N - число Авогадро. Радиус столкновения
обычно принимается равным сумме молекулярных радиусов флуорофора (Rf) и
тушителя (Rq). Вывод этого выражения будет рассмотрен более подробно в
разд. 9.7. Уравнение описывает диффузионный поток молекул с коэффициентом
диффузии D через поверхность сферы радиуса R. Фактор 1000 необходим для
соблюдения размерности в тех случаях, когда концентрация выражена в молях
на литр: умножением на (N/1000) молярность пересчитывают в молекулы/см3.
Частота столкновений связана с бимолекулярной константой скорости
тушения через эффективность тушения ?:

(9.12)

Например, если ? = 0,5, то только 50% диффузионных столкновений
приводят к тушению и kq должно быть равно kо/2. Так как k0 определяется с
достаточной точностью, наблюдаемое значение kq может быть использовано для
оценки эффективности тушения. У тушителей, подобных кислороду и I-
эффективность обычно близка к единице, а у более легких галогенов меньше.
Эффективность тушения аминами зависит от восстановительного
потенциала флуорофора, флуоресценция которого должна быть потушена, что и
следует ожидать для реакций с переносом заряда. Эффективность тушения может
быть рассчитана на основе наблюдаемого значения k если известны
коэффициенты диффузии и молекулярные радиусы. Радиусы можно найти из
молекулярных моделей или молекулярных масс и плотностей исследуемых
веществ. Коэффициенты диффузии можно вычислить по уравнению Стокса -
Эйнштейна:

(9.13)

где k - константа Больцмана; ? - вязкость растворителя. Часто при
расчетах по уравнению Стокса - Эйнштейна недооцениваются коэффициенты
диффузии малых молекул. Например, для тушения кислородом флуорофоров,
растворенных в различных спиртах, было вычислено, что эффективность тушения
составляет 2 - 3 [26]. Столь невероятно большие значения были получены
потому, что коэффициент диффузии кислорода на самом деле в несколько раз
больше, чем предсказываемый уравнением (9.13). Это уравнение описывает
диффузию молекул, по размерам превышающих молекулы растворителя, поэтому
оно неприменимо для кислорода в этаноле. Коэффициенты диффузии можно также
получить из номограмм, основанных на термодинамических и физических
свойствах систем [27]. Одна такая номограмма показана на рис. 9.26. Если
коэффициенты диффузии известны, то бимолекулярную константу скорости
тушения для ? = 1 можно предсказать, используя уравнение Смолуховского
[(9.11)].
Поучительно обсудить типичные значения kq и концентрации тушителя,
необходимые для проявления заметного тушения. Рассмотрим тушение тринтофана
кислородом [28]. При 25њС коэффициент диффузии кислорода в воде составляет
2,5 . 10-5 см2/с, а триптофана - 0,66 . :10-5 см2/с. Если принять радиус
столкновения равным 5 ?, то подстановка в уравнение (9.11) дает k0 = 1,2 .
1010 М-1 . с-1. Наблюдаемое значение константы Штерна - Фольмера для
тушения кислородом составляет 32,5 М-1. Так как время затухания для
триптофана в отсутствие тушителя - 2,7 нc, то kq = 1,2 . 1010 М-1 . с-1,
что находится в прекрасном соответствии с предсказанным значением.
Следовательно, по существу, каждое столкновение кислорода с триптофаном
приводит к тушению, т.е. ? = 1. Бимолекулярная константа скорости тушения
порядка 1 . 1010 М-1 . с-1 может рассматриваться как наибольшее из
возможных значений для водных растворов. Несколько большее значение для
тушения кислородом (порядка 2 . 1010 М-1 . с-1) можно получить в
углеводородных растворителях [26]. В случае тушения другими веществами
ожидается меньший диффузионный предел для константы скорости тушения,
потому что коэффициенты диффузии этих тушителей меньше. Например,
эффективность тушения флуоресценции триптофана акриламидом также порядка
единицы, но kq = 5,9 . 109 М-1 . с-1 [5]. Это несколько меньшее значение
получается вследствие меньшего коэффициента диффузии акриламида по
сравнению с кислородом.

9.3. Теория статического тушения
В предыдущем разделе рассматривалось тушение, связанное с
диффузионными столкновениями между флуорофором и тушителем в течение
времени жизни возбужденного состояния, - процесс, зависящий от времени.
Тушение может также происходить в результате образования нефлуоресцирующего
комплекса в основном состоянии между флуорофором и тушителем. Как только
произошло поглощение света, комплекс немедленно возвращается в основное
состояние без испускания фотона (рис. 9.1).
Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации тушителя легко
вывести, используя константу ассоциации комплекса, записываемую следующим
образом:

(9.14)

где [F -Q] - концентрация комплекса; [F] - концентрация несвязанного
флуорофора. Если закомплексованная форма не флуоресцирует, то доля
оставшейся флуоресценции (F/F0) определяется той частью от общего
количества флуорофоров, которая не закомплексована (f), т.е. f =F/F0 .
Общая концентрация флуорофора [F] равна

(9.15)

Подстановка в (9.14) дает

(9.16)

Концентрации флуорофора можно заменить на интенсивности флуоресценции
и преобразовать выражение (9.16) к виду

(9.17)

Отметим, что зависимость F0/F от [Q] идентична зависимости, получаемой
для динамического тушения, за исключением того, что константа скорости
тушения здесь заменяется константой ассоциации. Данные по тушению
флуоресценции, полученные по измерению интенсивности в случае, если нет
дополнительной информации, можно объяснить либо динамическими, либо
статическими процессами. Для идентификации статического и динамического
тушения можно использовать времена затухания или зависимость тушения от
температуры или вязкости. Измерение времени затухания флуоресценции -
наиболее четкий метод для различения статического и динамического тушений.
Из-за статического тушения часть флуорофоров не наблюдается. Связанные в
комплекс флуорофоры не флуоресцируют, и наблюдается флуоресценция только
несвязанных флуорофоров. Не связанная в комплекс часть флуорофоров не
возмущена, и, следовательно, для нее время затухания равно ?. Таким
образом, для статического тушения ?0 / ? = 1 (рис. 9.1), в то время как для
динамического тушения F0/F = ?0/?.
СРАВНЕНИЕ СТАТИЧЕСКОГО И ДИНАМИЧЕСКОГО ТУШЕНИЯ. Отличие Статического
тушения от динамического часто может быть установлено не только измерением
времен затухания, но и путем рассмотрения других факторов. Динамическое
тушение зависит от диффузии. Поскольку повышение температуры приводит к
увеличению коэффициентов диффузии, можно ожидать, что бимолекулярная
константа скорости тушения возрастет с увеличением температуры (рис, 9.1).
Точнее, следует ожидать, что kq будет пропорциональна Т/?, так как
коэффициенты диффузии пропорциональны этому отношению [уравнение (9.1З)].
Напротив, при росте температуры скорее всего уменьшается стабильность
комплексов и тем самым значения констант статического тушения.
Еще одним дополнительным методом для отличия статического тушения от
динамического может служить тщательный анализ спектра поглощения
флуорофора. Динамическое тушение влияет только на возбужденные состояния
флуорофоров, и можно полагать, что оно не изменит спектры поглощения. В
противоположность этому образование комплекса в основном состоянии часто
приводит к возмущению спектра поглощения флуорофора.
9.4. Смешанное динамическое и статическое тушение

Во многих случаях флуорофор может быть потушен за счет как
столкновений, так и образования комплекса с тушителем. Характерная
особенность графика Штерна - Фольмера в таких случаях - отклонение вверх и
вогнутость по отношению к оси у (рис. 9.2). Остаточная флуоресценция (F/F0)
определяется произведением доли, не связанной в комплекс (f), и доли, не
потушенной диффузионными столкновениями.
[pic]
РИС. 9.2. Графические зависимости для смешанного динамического и
статического тушения флуорофоров одного вида.

Следовательно,

(9.18)

В предыдущем разделе было показано, что f-1 = 1 +КСТ [Q]. Инверсия
уравнения (9.18) и перестановка в правую часть последних членов дает

(9.19)

Эта модифицированная форма уравнения Штерна - Фольмера является
уравнением второго порядка относительно [Q], что объясняет изгиб графика
кверху, наблюдаемый, когда флуорофор одновременно тушится как по
статическому, так и по динамическому механизму.
Доля динамического тушения в наблюдаемом уменьшении флуоресценции
может быть определена по изменению времен затухания, т.е. по зависимости
?0/? = 1 + Кдин [Q]. Если таких данных нет, то уравнение (9.19) может быть
преобразовано для графического определения КСТ и Кдин , После перемножения
членов в скобках получится

(9.20) (9.21)
(9.22)

Кажущаяся константа скорости тушения Ккаж вычисляется для каждой
концентрации тушителя. График зависимости Ккаж от [Q] представляет собой
прямую линию с отсекаемым на оси у отрезком, равным КСТ + Кдин, и наклоном,
равным КСТКдин (рис. 9.2). Индивидуальные значения констант могут быть
получены из двух решений квадратного уравнения [уравнение (9.23)].
Динамическую составляющую обычно выбирают либо как решение, сравнимое по
величине с ожидаемым диффузионно-контролируемым значением, либо по
зависимости от температуры или вязкости, либо по другой имеющейся
информации.

9.5. Примеры статического и динамического тушения
Прежде чем перейти к другим теориям и примерам, связанным с тушением,
рассмотрим несколько примеров, которые иллюстрируют статическое и
динамическое тушение. Данные по тушению триптофана кислородом приведены на
рис. 9.3 [28]. График в координатах Штерна - Фольмера представляет собой
прямую, что указывает на проявление только одного механизма тушения.
[pic]
РИС. 9.3. Графическое представление тушения флуоресценции триптофана
кислородом, наблюдаемое по изменению времен затухания в возбужденном
состоянии и квантовых выходов флуоресценции.

Пропорциональное уменьшение времени затухания и квантового выхода
флуоресценции показывает, что наблюдаемый тип тушения обусловлен
диффузионным процессом. Из наклона графика Штерна - Фольмера можно
вычислить Кдин = 32,5 М-1, или что 50% флуоресценции тушится при
концентрации кислорода 0,031 М. Значений Кдин и времени затухания
флуоресценции достаточно для вычисления бимолекулярной константы скорости
тушения. Получаем kq = 1,2 . 1010 М-1 . с-1. Такое большое значение
указывает на эффективное тушение молекулярным кислородом.

На рис. 9.4 приведены данные по тушению N-ацетил-L-триптофанамида
акриламидом [5], который также эффективно тушит флуоресценцию триптофана.
В этом случае на графике Штерна - Фольмера виден существенный изгиб кривой
к оси у. В противоположность ожидаемому причиной отклонения графика Штерна
- Фольмера в положительную сторону не является образование комплекса.
Предполагается, что при высоких концентрациях тушителя часть флуорофоров
оказывается соседствующей с тушителем в момент возбуждения и, таким
образом, мгновенно дезактивируется. Этот эффект будет более подробно описан
в разд. 9.6. Доля динамического тушения акриламидом может быть вычислена
путем деления на переменную еv[Q], описывающую эффект близости, и, таким
образом, получают прямую в координатах Штерна - Фольмера.[pic]РИС. 9.4.
Графическое представление тушения N-ацетил-L-триптофанамида акриламидом в
55%-ном глицерине [5].
Измерение времен затухания подтвердило, что эта часть тушения имеет
динамическую природу. Бимолекулярные константы тушения, определенные в ряде
растворителей, приведены на рис. 9.5. Эти константы приблизительно линейно
зависят от T/?, что служит хорошим доказательством диффузионной природы
тушения акриламидом, Противоположные данные были получены по тушению N-трет-
бутилоксикарбонилтриптофана ионами ртути, как показано на рис. 9.6 [29].
Приблизительно 50% флуоресценции тушится при концентрации [Нg2+] = 20 . 10-
5 М, и, следовательно, константа тушения равна 5000 М-1. Если принять во
внимание время затухания флуоресценции N-mpem-бутилоксикарбонилтриптофана,
составляющее 8 нc, то кажущаяся бимолекулярная константа тушения окажется
равной 6,25 . 1011 М-1 . с-1. Полученное значение больше, чем это возможно
для диффузионно-контролируемой реакции, поэтому следует предположить
образование комплекса между Hg2+ и производным триптофана. Измерение времен
затухания флуоресценции подтверждает, что тушение имеет статическую
природу. Время затухания не меняется в присутствии ионов ртути (рис. 9.6).
В противоположность действию кислорода или акриламида тушение ионами ртути
происходит вследствие образования нефлуоресцирующего комплекса между Hg2+ и
N-трет-бутилоксикарбонилтриптофаном.

[pic]
РИС. 9.5. Зависимость тушения N-ацетил-L-триптофанамида акриламидом от
температуры и вязкости. 1 - водный раствор при разл