Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://www.enzyme.chem.msu.ru/eduproc/prac/task9/part07.doc Дата изменения: Fri Feb 13 20:22:07 2004 Дата индексирования: Mon Oct 1 23:24:37 2012 Кодировка: koi8-r Поисковые слова: флуоресценция

ГЛАВА 7.
Влияние растворителей на спектры флуоресценции
На спектры флуоресценции многих флуорофоров влияет полярность
окружающей среды. Например, при исследовании спектров испускания такого
зонда, как 1-анилино-8-нафталинсульфоновая кислота (ANS), в растворителях
различной полярности можно заметить, что спектр испускания сдвигается в
сторону коротких длин волн ("голубой" сдвиг) при уменьшении полярности
растворителя. Наоборот, увеличение полярности растворителя чаще всего
приводит к смещению спектра испускания в длинноволновую сторону ("красный"
сдвиг). Типичные спектры чувствительных к растворителю флуорофоров
приведены на рис. 7.2 и 7.5. Красные сдвиги часто, но отнюдь не всегда,
сопровождаются уменьшением квантового выхода флуоресценции.
Спектры испускания можно считать наиболее легко измеряемыми
спектральными характеристиками. Этот факт, а также общая чувствительность
флуорофоров к влиянию растворителей послужили причиной многочисленных
публикаций, в которых проводится анализ спектров испускания флуорофоров,
связанных с белками, мембранами, нуклеиновыми кислотами и более сложными
совокупностями макромолекул. В основном стараются использовать
чувствительность флуорофора к растворителю для того, чтобы сделать вывод о
полярности места присоединения к макромолекуле. Например, найдено, что
спектр испускания ANS , присоединенной к апомиоглобину, сильно сдвинут в
коротковолновую область; это позволило предположить, что ANS связана с
гемовой частью и недоступна для внешней водной фазы (разд. 7.5.2).
В последующих разделах будет рассмотрена физическая природа таких
зависящих от полярности спектральных сдвигов. Эти сдвиги являются
результатом как взаимодействий дипольных моментов флуорофоров с реактивными
полями, индуцируемыми в окружающем растворителе, так и специфического
химического взаимодействия флуорофора с одной или более молекулами
растворителя. Описывая влияния растворителя, мы проиллюстрируем
интерпретацию спектров испускания, касающуюся локализации флуорофоров,
связанных с белками и мембранами. Зависящие от растворителя сдвиги требуют
реорганизации ячейки растворителя, в которой находится флуорофор, и
поэтому зависят от времени. Динамика процессов релаксации растворителя
будет обсуждаться в гл. 8 в предположении, что взаимодействие растворитель
- флуорофор достигает равновесия до процесса испускания. Такое
предположение является разумным для случая невязких растворителей при
температуре, близкой к комнатной.
7.1. Стоксовы сдвиги и релаксация растворителя
Испускание флуоресценции обычно происходит при длинах волн, больших,
чем те, которые соответствуют поглощению. Такая потеря энергии между
процессами поглощения и переиспускания, или стоксов сдвиг, - это результат
нескольких динамических процессов. Сюда относятся потери энергии вследствие
диссипации колебательной энергии, перераспределение электронов в окружающих
флуорофор молекулах растворителя, вызванное изменением (чаще всего
увеличением) дипольного момента флуорофора при возбуждении, переориентация
молекул растворителя вокруг возбужденного диполя, а также специфические
взаимодействия между флуорофором и растворителем или растворенными
веществами. В понятие специфических взаимодействий входит образование
водородных связей и комплексов с переносом заряда. Практически невозможно
дать полное количественное описание всех этих процессов и их влияния на
спектральные свойства флуорофоров, что не удивительно, если npинять во
внимание структурное разнообразие флуорофоров. Точная интерпретация
чувствительности флуорофоров к растворителю требует детального понимания
влияния растворителей на уровни энергий как основного, так и возбужденного
состояния флуорофоров. Тем не менее мы можем использовать простейшие
теории, описывающие взаимодействие растворитель - флуорофор, чтобы
интерпретировать спектральные свойства в терминах усредненного окружения
флуорофора.
Поглощение света происходит примерно за 10-15с, т.е. за время слишком
короткое, чтобы успело произойти значительное смещение ядер (принцип Франка
- Кондона), но вполне достаточное для перераспределения электронной
плотности. Обычно в электронно-возбужденных состояниях у ароматических
соединений дипольные моменты (?*) больше, чем в основном состоянии (?).
[pic]
РИС. 7.1. Диаграмма Яблонского, иллюстрирующая явление флуоресценции.

В результате при поглощении флуорофором фотона, по существу,
происходит мгновенное образование диполя, который оказывает возмущающее
действие на окружение флуорофора. Вслед за процессом возбуждения происходит
реорганизация клетки растворителя, окружающей флуорофор. Этот процесс
называется релаксацией растворителя (рис. 7.1), масштаб времени которой
зависит от физических и химических свойств растворителя.
ОБЩИЕ И СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ВЛИЯНИЯ РАСТВОРИТЕЛЯ.
Известно, что спектры испускания многих флуорофоров, особенно
содержащих полярные заместители в ароматическом кольце, зависят от
химических и физических свойств растворителей. На эту тему опубликовано
множество детальных работ, предметом которых является объяснение влияния
растворителей на спектры флуоресценции в рамках единственного формализма.
Предлагаемые теории чаще всего слишком сложны для обычного
использования. Мы предпочитаем более простой подход, в котором влияние
растворителей на спектры флуоресценции делится произвольным образом на
общее и специфическое. Под общими эффектами мы подразумеваем те, которые
зависят от показателя преломления п и диэлектрической постоянной ? -
физических констант, отражающих свободу движения электронов в молекулах
растворителя и ди-польный момент этих молекул. Специфические влияния
растворителей мы связываем со специфическими химическими взаимодействиями
между флуорофором и молекулами растворителя (это, в частности, образование
водородных связей и комплексов). Как общие, так и специфические влияния
растворителей могут приводить к значительным спектральным сдвигам.
Разделение этих эффектов на две категории удобно из-за различной природы
спектральных сдвигов. Можно полагать, что общие эффекты всегда будут
присутствовать. В противоположность этому специфические эффекты будут
зависеть от конкретной химической структуры молекул растворителя и
флуорофора.
Отметим, что величины спектральных сдвигов, обусловленных
специфическими взаимодействиями растворителя и флуорофора, часто превышают
соответствующие величины, связанные с общими взаимодействиями. Кроме того,
специфические эффекты, как правило, проявляются для флуорофоров,
используемых в биохимических исследованиях. По этим причинам разделение
влияния растворителей на такие две категории удобно и информативно. Для
количественного описания общих эффектов растворителей будет приведена одна
простая теория, в рамках которой специфические эффекты легко оценить как
отклонения от нее.
7.2. Общие влияния растворителей на спектры флуоресценции. Уравнение
Липперта
Для описания влияния физических свойств растворителей на спектры
испускания имеется множество уравнений. Эти выражения, как правило, сложны,
но часто недостаточно раскрывают природу влияния растворителей. Мы приведем
только наиболее широко используемое выражение, предложенное Липпертом и др.
[ 1 - 3]. Для знакомства с более сложными уравнениями мы отсылаем читателей
к работам Бахшиева [6-8], посвященным этому вопросу. В цитируемых работах
растворитель рассматривается как некий континуум, содержащий молекулы
флуорофора. При таком упрощенном подходе область применения уравнений,
вероятно, ограничена вследствие того, что из рассмотрения исключаются
специфические взаимодействия флуорофор - растворитель, которые могут
оказывать значительное влияние на спектры испускания. Однако общие влияния
растворителей всегда проявляются, поэтому количественная оценка величины
ожидаемых эффектов дает границы, в которых можно анализировать
экспериментальные данные.
Взаимодействие между молекулами растворителя и флуорофора оказывает
влияние на разность энергий между основным и возбужденным состояниями. В
первом приближении эта разность энергии (в см-1) зависит от показателя
преломления п и диэлектрической постоянной ? растворителя и описывается
уравнением Липперта [1 - 3]
[pic] (7.1)
где h - постоянная Планка; с - скорость света; ? - радиус полости,
внутри которой находится флуорофор; ?? и ?f - волновые числа,
соответствующие поглощению и испусканию (см-1). Хотя уравнение (7.1)
является только приближенным, существует разумная корреляция между
наблюдаемыми и расчетными значениями потерь энергии в апротонных
растворителях. Под апротонными растворителями мы подразумеваем
растворители, не содержащие гидроксильных или других групп, способных
образовывать водородные связи. В этом уравнении пренебрегают членами
высшего порядка, которые могли бы обусловить эффекты второго порядка, в
частности появление индуцированных дипольных моментов в отдельных молекулах
растворителя в результате влияния дипольных моментов возбужденного
состояния, и наоборот.
Полезно рассмотреть противоположное влияние величин ? и п на стоксов
сдвиг. Увеличение п будет уменьшать его величину, тогда как рост ? приводит
к увеличению ?? - ?f. Такое различие является следствием принципа Франка -
Кондона и лучше всего объясняется при выводе уравнения Липперта (разд.
7.3). Вкратце его можно представить следующим образом. Увеличение
показателя преломления приводит к мгновенной стабилизации как основного,
так и возбужденного состояний, обусловленной смещением электронов в
молекулах растворителя. Перераспределение электронной плотности приводит в
свою очередь к уменьшению разности энергий основного и возбужденного
состояний. Увеличение ? также способствует стабилизации основного и
возбужденного состояний.

Однако уменьшение энергий возбужденного состояния происходит только
после переориентации диполей растворителя, для чего необходимо движение
всей молекулы растворителя, а не только ее электронов. В результате
стабилизация основного и возбужденного состояний флуорофора, которая
зависит от диэлектрической постоянной ?, является функцией времени, а
скорость стабилизации зависит от температуры и вязкости растворителя (гл.
8). Следовательно, время понижения энергии возбужденного состояния сравнимо
со временем переориентации диполей растворителя. При выводе уравнения
Липперта (разд. 7.3), а также по всей данной главе предполагается, что
релаксация растворителя происходит полностью до процесса испускания
флуоресценции.
Член в скобках в уравнении (7.1) называется ориентационной
поляризуемостью и обозначается ?f. Первый член [(? - l)/(2? + 1)] относится
к спектральным сдвигам, обусловленным как переориентацией диполей
растворителя, так и перераспределением электронной плотности в молекулах
растворителя. Второй член [(n2 - 1)/(2n2 + 1)] соответствует только
перераспределению электронной плотности. Разность этих двух членов
объясняет спектральные сдвиги, определяемые переориентацией молекул
растворителя. Согласно этой простой теории, к значительным стоксовым
сдвигам приводит только переориентация растворителя. Перераспределение
электронной плотности происходит мгновенно, и как основное, так и
возбужденное состояния приблизительно в равной мере стабилизируются этим
процессом. В результате перераспределение электронной плотности оказывает
сравнительно слабое влияние на стоксов сдвиг.
Полезно также рассчитать, какие величины спектральных сдвигов могут
вызвать общие эффекты растворителей. Предположим, например, что дипольный
момент меняется на (?* - ?) = 20 дебаев (D) и что радиус полости равен 4 е.
Такое значение сравнимо с радиусом типичных ароматических флуорофоров. 4,8
D - это дипольный момент, соответствующий переходу единичного заряда (4,8
10-10 ед. СГСЭ) на расстояние 1 е (10-8 см). Следовательно, 20 D
соответствует переносу единичного заряда на 4,2 е - расстояние, сравнимое с
размером молекулы флуорофора. Такое предполагаемое значение (?* - ?)
аналогично величинам, наблюдаемым для флуорофоров, которые часто используют
в качестве меток в биохимических исследованиях и рассматривают как
индикаторы полярности растворителя. Например, разность ?* - ? = 20 D была
получена [9] .для 2-анилинонафталина, а 15 D -для 2-п-толуидинилнафталин-6-
сульфонамида. Такие большие значения, как 44 D наблюдали для 2-анилино-6-
нафталинсульфоновой кислоты, но они могут быть результатом специфических, а
не общих взаимодействий с растворителем.
Для излагаемой модели расчета стоксовых потерь сравним неполярный
растворитель гексан с полярным растворителем метанолом. Неполярные
Таблице 7.1. Стоксовы сдвиги, ожидаемые для случая общих влияний
растворителя



б Из уравнения (7.1) в предположении, что ?* - ? = 20D, а радиус
полости 4 е. 4,8D - дипольный момент, получающийся при разделении заряда,
равного единице заряда (4,8-10-10 ед. СГСЭ) на 1 е (10-8 см).
в В предположении, что максимум поглощения равен 350 нм.

растворители, такие, как гексан, не имеют дипольного момента.
Следовательно, в данном случае не существует диполей, которые могли бы
переориентироваться относительно возбужденного состояния флуорофора. Это
физическое свойство гексана выражается в том, что ? = n2. Из уравнения
(7.1) можно получить небольшое значение ориентационной поляризуемости ?f и
можно ожидать, что ?а - ?f, будет мало или равно нулю. Например, если
предположить, что модельный флуорофор поглощает при 350 нм, рассчитанная
длина волны испускания в гексане будет равна 350,4 нм (табл. 7.1). Однако
даже в неполярных растворителях не наблюдается такого близкого совпадения
максимумов поглощения и испускания. Возбуждение обычно происходит на более
высокие колебательные уровни, и избыток энергии быстро диссипирует в жидких
растворах (за 10-12с). Процесс испускания обычно происходит после
дезактивации возбужденных колебательных состояний (см. рис. 7.1). В
результате поглощение и испускание обычно сдвинуты друг от друга на
величину, по крайней мере, равную колебательной энергии, т.е. на — 500 см-
1. Такие потери энергии входят в постоянный член уравнения (7.1) и должны
были бы для нашего модельного флуорофора сместить максимум испускания к 370
нм.
В полярных растворителях, таких, как метанол, можно ожидать
значительно больших стоксовых потерь (табл. 7.1). Например, ожидаемое
положение максимума для рассматриваемого модельного флуорофора составит в
полярном растворителе 531 нм. Такой сдвиг обусловлен большей ориентационной
поляризуемостью в метаноле, являющейся результатом дипольного момента этого
растворителя. Чувствительность величин стоксовых сдвигов к полярности
растворителя служит причиной того, почему спектры флуоресценции часто
используют для определения полярности окружения флуорофора.
Известно, что на спектры испускания многих флуорофоров влияет
полярность растворителя. Например, в большинстве случаев флуоресценция
белков обусловлена индольным кольцом триптофановых остатков (гл. 11).
Положение максимума испускания индола меняется от 297 нм в циклогексане до
347 нм в воде [11]. Для природных белков найдено множество максимумов
испускания, и денатурация этих белков обычно приводит к сдвигам до таких же
или больших длин волн испускания. Таким образом, считают, что максимумы
испускания белков отражают среднюю степень доступности триптофановых
остатков для водной фазы. Другим примером использования спектров испускания
для оценки полярности может служить зонд TNS , который широко применяется
для этой цели начиная с работы Вебера и Лоуренса [12]. TNS и сходные с ним
молекулы в основном не флуоресцируют в водном растворе, но проявляют
интенсивную флуоресценцию в неполярных растворителях или при связывании с
белками и мембранами. С помощью высокочувствительных зондов можно получать
информацию о полярности их непосредственного окружения. Например, максимум
испускания TNS сдвигается от 413 нм в диоксане до 500 нм в воде [13].
Известны и еще более чувствительные зонды, такие, как 6-пропионил-2-
(диметиламино)нафталин (FRODAN), описанный Вебером и Фаррисом [ 14].
Спектры испускания PRODAN в различных растворителях приведены на рис. 7.2.
Видно смещение максимума испускания от 392 нм в циклогексане до 523 нм в
воде. Высокая чувствительность PRODAN к полярности растворителя
определяется большим изменением дипольного момента при возбуждении.
Объяснением этого может служить локализация положительных и отрицательных
зарядов на амино- и карбонильной группах соответственно [15],.Эти группы
расположены на противоположных концах нафталинового фрагмента, и поэтому в
результате разделения зарядов происходит значительное изменение дипольного
момента.
Количественному изучению спектральных сдвигов посвящено множество
исследований, что вполне можно понять, поскольку спектр испускания легко
измеряется. Однако часто возникают обратные задачи. Например, что можно
сказать на основе спектра испускания флуорофора, связанного с
макромолекулой, о природе места его присоединения? Является ли оно
полярным, неполярным или средней полярности? Доступно ли оно для воды или
находится внутри белка или мембраны? Жестко ли оно во временной шкале
испускания флуоресценции или подвижно и чувствительно к возбуждению
флуорофора?
На подобные вопросы трудно ответить, имея в распоряжении только Данные
о спектрах испускания. Трудность интерпретации связана со сложностью
процессов взаимодействия флуорофора с окружающей средой, а также с влиянием
процессов, происходящих в возбужденном состоянии (таких, как наносекундная
релаксация спектра), на наблюдаемые спектры испускания.
[pic]
РИС. 7.2. Спектры испускания флуоресценции PRODAN [14]. Растворители
(слева направо): циклогексан, хлорбензол, диметипформамид, этанол, вода.

Из сравнения спектров испускания флуорофоров, находящихся в растворах
и связанных с макромолекулами, часто предполагают, что процессы релаксации
растворителя заканчиваются полностью до процесса испускания. Если процессы
релаксации не закончились, наблюдается испускание излучения
нерелаксированных флуорофоров [16], которое сдвинуто в коротковолновую
область по сравнению с релаксированным состоянием. Далее, при таких
корреляциях предполагают, что наблюдаемые спектральные сдвиги обусловлены
только общими эффектами растворителя. Для многих обычно используемых
флуорофоров, таких, как TNS и 2-AN, к значительным спектральным сдвигам
могут приводить и специфические влияния растворителей. Эти эффекты могут
затруднить сравнение спектров, наблюдаемых для одного и того же флуорофора
в растворах и связанного с макромолекулой.

7.5. Практическое применение влияния растворителей в биохимических
исследованиях
7.5.1. Локализация связанных с мембранами флуорофоров
В предыдущем разделе были перечислены трудности, встречающиеся при
строгой интерпретации спектров испускания флуоресценции, а также примеры,
иллюстрирующие наиболее существенные спектральные сдвиги, которые являются
результатом специфических взаимодействий флуорофоров с растворителями и
поэтому требуют осторожности при интерпретации данных. Несмотря на
существование как общих, так и специфических взаимодействий с
растворителем, обычно можно получить информацию о свойствах среды,
окружающей флуорофор, из анализа его спектров испускания. В этом аспекте
особенно показательна работа [25]. Были исследованы три связанных с
мембранами зонда: 12-(9-антроилокси)стеариновая кислота (12-AS), N-
дансилфосфатидилэтаноламин (DPE) и М-октадецилнафтил-2-амино-6-сульфоновая
кислота (ONS). Зонды были внедрены в модельные мембраны, а информацию о
месте их присоединения по отношению к поверхности раздела липидная фаза -
вода получали из анализа их спектров испускания, которые сравнивали со
спектрами аналогичных эталонных соединений в растворителях с варьируемой
полярностью. Структурные формулы эталонных соединений показаны на рис.
7.14.
Спектральные данные для 12-AS приведены на рис. 7.15. В верхней части
рисунка изображены спектры испускания 12-AS в растворителях различной
полярности. При увеличении полярности спектры испускания сдвигаются в
сторону больших длин волн. Максимум спектра испускания AS, связанного с
двойным слоем фосфатидилхолина, занимает промежуточное положение между
максимумами испускания AS в гексане и бензоле. Из этих Данных авторы
заключают, что флуоресцирующая часть молекулы AS локализована на жирной
ацильной цепочке мембран и не подвергается влиянию полярного водного
растворителя. Были измерены также времена затухания флуоресценции AS .
Увеличение полярности растворителя приводит к уменьшению времени затухания.
Время затухания флуоресценции 12-AS в мембране не больше, чем в любом из
эталонных растворителей (рис. 7.15, в). Этот результат является
дополнительным подтверждением того, что AS локализована в области
неполярных цепочек мембран и может служить в качестве зонда для этой
области мембран.
[pic]
РИС. 7.14. Структурные формулы флуоресцентных зондов для мембран.
Соединения IV и V использованы в качестве эталонных для анализа
зависимости спектров испускания от природы растворителя. (С разрешения
авторов работы [25].)

[pic]
РИС. 7.15. Спектральные свойства 12-AS в растворах и связанного с
мембранами.
а - спектры испускания; б - положение максимумов испускания в
различных растворителях; в - иллюстрация законов затухания флуоресценции
при временах затухания: 1,6 (М); 3.4 (Э); 5,6 (Бу); 8,5 (Г); 12,4 нс (ФХ).
Сокращения: Г - гексан, Б - бензол, Э - этанол, М - метанол, Бу -бутанол,
ФХ - фосфатидипхолин. (С разрешения авторов работы [25].)

Интересно отметить, что локализация антроильного кольца в неполярной
области мембран происходит только при наличии цепочки стеариновой кислоты.
Такой вывод сделан на основании изучения положения максимумов испускания
соединений IV и V(рис. 7.14), связанных с мембранами ФХ (рис. 7.15).
Максимумы испускания подобных соединений с меньшей молекулярной массой
указывают на их более высокую полярность, чем у AS . Зависимость спектров
[pic]
РИС. 7.16. Положение максимумов испускания мембранных зондов в
различных растворителях и двойных слоях ФХ [25].
Сокращения те же, что и на рис. 7.15. В - вода.

от растворителя была получена для каждого из соединений (AS, IV и V),
что очень важно, так как даже, казалось бы, небольшие изменения структуры
могут привести к смещению спектров испускания. Этот факт иллюстрирует рис.
7.15. Положение максимумов спектров испускания соединений AS, IV и V по-
разному зависит от полярности растворителя.
Авторы работы [25] исследовали также положение максимумов испускания
DPE и ONS и сравнили эти величины с полученными для тех же флуорофоров в
различных растворителях (рис. 7.16). Максимум испускания ONS, связанного с
ФХ, аналогичен найденному для ONS в смеси метанол + вода, из чего можно
сделать вывод о том, что при связывании с мембраной флуорофор попадает в
окружение высокой полярности. Немного менее полярное окружение было
обнаружено для DPE . Из этих данных авторы заключили, что ONS является
зондом для поверхности раздела липидная фаза - вода, DPE -для глицериновой
цепочки, a AS - для ацильных боковых цепочек мембран.
7.5.2. Локализация связанных с белками флуорофоров
Соображения, аналогичные изложенным в предыдущем разделе,
использовали, чтобы показать, что ANS связывается с гемовой частью
апомиоглобина и что в основном ANS недосягаема для водной фазы [26]. На
рис. 7.17 изображены спектры ANS в одноатомных спиртах с различными
молекулярными массами. При увеличении длины молекулы спирта относительный
квантовый выход возрастает, а максимум испускания сдвигается в сторону
коротких длин волн. В октаноле максимум испускания ANS находится вблизи 462
нм. При добавлении апомиоглобина к водному раствору ANS интенсивность
флуоресценции возрастает в 200 раз (рис. 7.18).

[pic]
РИС. 7.17. Спектры испускания флуоресценции ANS в различных спиртах.
При уменьшении полярности растворителя квантовый выход увеличивается,
а максимум спектра испускания сдвигается в сторону коротких длин волн.
Сокращения Эг -этиленгликоль, М - метанол, Э - этанол, П - пропаноп, Бу -
бутанол и О - н-октанол. (С разрешения авторов работы [26] и Academic
Press, Inc.)

Максимум испускания находится при 454 нм, что даже короче, чем для ANS
в октаноле. В воде квантовый выход флуоресценции ANS составляет ~0,004, а
максимум испускания приходится на 515 нм. Относительный квантовый выход
флуоресценции для раствора ANS + апомиоглобин выше, чем для октанольного
раствора (0,98.и 0,63 соответственно). Тот факт, что увеличение квантового
выхода и коротковолновый сдвиг спектров при смешивании ANS с апомиоглобином
обусловлены присоединением к гемовой части молекулы, подтверждается
влиянием гемина на флуоресценцию ANS. Добавка 1 моль гемина на моль
апомиоглобина приводит к полному исчезновению возрастания флуоресценции
ANS. На основании этих результатов авторы делают вывод о том, что ANS была
связана в неполярной части молекулы апомиоглобина, вероятнее всего - в щели
тема.
ANS и сходные с ней соединения широко используют из-за малых квантовых
выходов флуоресценции в воде. Однако иногда требуется еще большая
чувствительность спектров испускания к полярности, и выше мы отмечали, что
крайне высокой чувствительностью к природе растворителя обладает PRODAN
(см. рис. 7.2). Спектр испускания PRODAN очень сильно смещается в сторону
коротких длин волн при связывании его с бычьим сывороточным альбумином. Как
и в случае ANS, квантовый выход PRODAN возрастает при присоединении его к
гидрофобной части белка [14]. В отличие от ANS интенсивность увеличивается
только в три раза, поэтому отчетливо наблюдается испускание как связанных,
так и свободных молекул (рис. 7.19). Это свойство может быть ценным, если
необходимо измерить концентрации как свободного, так и связанного зонда.
[pic]
РИС. 7.18. Спектры испускания и возбуждения флуоресценции ANS,
связанной с апомиоглобином. (С разрешения авторов работы [26] и Academic
Press Inc.)

[pic]
РИС. 7.19. Спектры испускания флуоресценции PRODAN в воде и связанного
с бычьим сывороточным альбумином.
1 - 3 мкМ PRODAN а воде; 2 - 5 с добавками 38 (2), 75 (3), 150 (4) и
300 (5) мкМ бычьего сывороточного альбумина.
(С разрешения авторов работы [14] и American Chemical Society.)

Вебер рассчитал полуширины спектров испускания свободных и связанных
молекул PRODAN, т.е. ширину (в см-1) исправленного спектра испускания на
половине высоты (50% интенсивности). Было найдено, что полуширина связанной
формы больше, чем для PRODAN в водном растворе. В следующей главе будут
рассмотрены наносекундные процессы релаксации в качестве одной из причин
увеличения полуширины спектра для связанного флуорофора (релаксация
протеиновой матрицы относительно дипольного момента возбужденного состояния
PRODAN). Поскольку релаксация происходит со скоростью, сравнимой с временем
затухания флуоресценции, испускание происходит из набора частично
релаксированных состояний. Известно, что полуширина для такого усредненного
испускания увеличена. Полученные результаты свидетельствуют о сложности
интерпретации спектров флуоресценции для зондов, связанных с белками и
мембранами. Если релаксация вокруг возбужденного состояния флуорофора
происходит не полностью, спектры флуоресценции в стационарном состоянии не
совсем точно отражают полярность окружающей среды.