Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://www.chem.msu.ru/rus/chemhist/istkhim/referat.html
Дата изменения: Unknown
Дата индексирования: Fri Feb 28 05:48:14 2014
Кодировка: Windows-1251
Поисковые слова: нобелевская премия
История иммуноанализа
К оглавлению учебных материалов

История иммуноанализа
Реферат по истории химии
студентки 508 группы
Лобановой Анны Юрьевны
 Петр Зоркий, Химфак МГУ

Содержание

Введение
Часть 1. Истоки
1.1.Протоиммунология
1.2.Первые теории приобретенного иммунитета.
1.2.1.Теория изгнания
1.2.2.Теория истощения
1.3.Открытие вакцинации. Работы Э. Дженнера
1.4.Рождение экспериментальной иммунологии. Луи Пастер и Роберт Кох
1.5.Иммунизация и сывороточная терапия. Введение понятий антиген - антитело
1.6.Изучение реакции антиген - антитело. Появление иммунохимии
1.6.1.Теория Эрлиха
1.6.2.Иммунодиагностика
1.6.3.Аутоиммунитет
1.7.Теории клеточного и гуморального иммунитета
1.8.Теории образования антител
1.8.1. Теория боковых цепей Эрлиха
1.8.2. Инструктивные теории образования антител
1.8.3. Селективные теории образования антител
Часть 2. Нобелевские лауреаты в иммунологии
Часть 3. Современная иммунохимия
Литература

Введение

Иммунохимические методы анализа, основанные на специфическом связывании определяемого соединения соответствующими антителами, широко вошли в аналитическую практику и используются в различных областях медицины, сельского хозяйства, микробиологической и пищевой промышленности, для целей охраны окружающей среды. В основе иммуноанализа лежит наука иммунология, изучающая процессы выработки антител в организме в ответ на попадание чужеродного тела (антигена).
Изучая историю иммуноанализа, необходимо рассмотреть эволюцию общих идей и понятий, связанных с формированием ранних представлений об иммунитете.
Хронологически в имунологии можно выделить два больших периода. Первый - период протоиммунологии, связанный со стихийным, умозрительным познанием защитных (иммунных) реакций организма. Его протяженность - от античности до последней трети 80-х годов 19 века. Второй этап - период экспериментальной и теоретической иммунологии - начинается в 80-е годы 19 века и оканчивается вторым десятилетием 20 века. Оба периода характеризуют зарождающуюся науку.
Второе десятилетие 20 века является определенным рубежом в истории иммунологии. Прежде всего, тогда завершилось формирование классической иммунологии, так называемого инфекционного периода развития науки. Кроме того, это время социального признания иммунологии как науки. В начале 20-го века Э. Беренг, Р. Кох, И. Мечников и П. Эрлих, Шарль Рише, Жюль Борде были удостоены Нобелевской премии за исследования в теоретической и прикладной иммунологии. Такая высокая оценка несомненно свидетельствовала о серьезном научном и социальном авторитете иммунологических исследований уже в начале 20 века.
Объектами иммунологов стали разнообразные иммуннные реакции, антитела, антигены, клетки иммунной системы и пр. В процессе развития иммунологии были созданы особые методы исследования, которые характеризовались необычайной чувствительностью и точностью, недоступной для методов других дисциплин. Появились крупные монографии, учебники и периодические специализированные издания.
Уже к концу первого десятилетия 20 века просматривается решительная перегруппировка сил в пользу иммунохимии, задачу которой сам автор термина 'иммунохимия' Сванте Аррениус сформулировал как 'приложение законов физической химии к изучению биологических антител'. К концу второго десятилетия иммунология распалась на отдельные направления. При этом фундаментальные исследования природы иммунитета целиком ушли в область иммунохимии, которая объединила вокруг себя талантливейших ученых самых разных специальностей (К. Ландштейнер, В. Паули, М. Гейдельберг, Ф. Гауровитц, Ж. Борде, К. Оппенгеймер, Ф. Обермайер, Л. Михаэлис).
В 1960 - 1970-е годы социальное оформление иммунологии включило в себя все формы институционализации: профессиональные институты, основание специальных кафедр иммунологии в высших учебных заведениях для подготовки специалистов, организация научных обществ и международных союзов.

Часть 1. Истоки
1.1. Протоиммунология.



Термин 'иммунитет' происходит от латинского 'immunitas', означающего 'освобождение, избавление от чего-либо'. Исторически в средневековой Европе в IX -XV веках им обозначалась привилегия избранных феодалов на обладание правами политической власти над населением вотчин.
Только в XIX веке благодаря широкому распространению вакцинации, создающей иммунитет к оспе, термин 'иммунитет' стал постепенно входить в медицинскую литературу. В этом новом (медицинском) качестве - как 'освобождение от болезни' - его впервые в 1869 г. официально закрепил французский словарь Литте.
Однако задолго до появления термина 'иммунитет' в медицине уже существовало понятие иммунитета в значении невосприимчивости человека к болезни, которое обозначалось другими терминами (умозрительными и эмпирическими). Например, у Гиппократа это 'природа (фюзис) организма' или 'самоисцеляющая сила организма' ('vis medicatrix naturae'), у Парацельса - 'залечивающая сила' ('мумие'), у Галена - 'жизненная сила'.
Народной медициной издавна отмечено явление стойкой невосприимчивости (резистентности) к повторному заражению после перенесенных тяжелых инфекций, таких как оспа, скарлатина, тиф. Это - приобретенный иммунитет. Уже древним цивилизациям была известна врожденная резистентность людей к болезням животных (куриной холере, чуме собак). Это естественный иммунитет.
Таким образом, иммунитет в своих феноменологических аспектах был выявлен уже давно, но сущность явления оставалась неизвестной.

1.2. Первые теории приобретенного иммунитета

.
Крупнейшей вехой в зарождении иммунологии явилось открытие во второй половине XVII в. эмпирических методов получения искусственного иммунитета к оспе - вакцинации, инокуляции, вариоляции.

1.2.1. Теории изгнания

Первое четкое описание клиники оспы дал мусульманский врач Разес (IX век). Он не только впервые дифференцировал оспу от кори и других инфекционных заболеваний, но и уверенно утверждал, что выздоровление от оспы вызывает длительный иммунитет. Чтобы объяснить этот феномен, он предложил теорию иммунитета, которая является первой в известной нам литературе. Считалось, что оспа поражает кровь, и Разес утверждал, что болезнь связана с брожением крови, которое помогает избавиться от 'избытка влаги', свойственной, по его мнению, крови молодых. Он полагал, что оспенные пустулы, которые возникают на коже, а потом лопаются с истечением жидкости, - это механизм, который освобождает тело от излишка влаги в крови. Такими процессами 'изгнания', 'освобождения' крови от избытка влаги объяснял он последующую длительную невосприимчивость переболевшего человека к оспе. Повторное заражение, по Разесу, невозможно, так как отсутствует субстрат для заражения. Невозможно заражение и стариков, у которых процесс старения 'высушил' кровь.
Таким образом, концепция Разеса объясняла не только приобретенный, но и естественный иммунитет.
В XI веке Авицина предложил другую теорию, которая спустя 500 лет была развита итальянским врачом Джироламо Фракастро в его книге 'О заразе'(1546 г.).
Различие концепций Разеса и Фракастро в субстратрате 'изгоняемого вещества': у Разеса изгоняется избыток влаги, а у Фракастро - остатки менструальной крови матери.
В каждом случае суть болезни видели в загнивании примеси и изгнание ее через пустулы, результатом чего является пожизненный иммунитет, основанный на отсутствии в организме субстрата для возникновения болезни при новом заражении.

1.2.2. Теория истощения.

Введение прививки, т.е. инокуляции материала от пораженного оспой больного, в качестве профилактического средства в начале 18-го века снова вызвало интерес к природе и механизмам приобретенного иммунитета. В 1721 году священник из Новой Англии Котон Мезер утверждал, что и естественная инфекция, и инокуляция приводит к истощению некоего неизвестного субстрата и из-за его отсутствия болезнь не может возникнуть повторно.
Идея о том, что иммунитет связан с истощением какой-то субстанции, необходимой для поддержания болезни, часто повторялась в 18 веке.

1.3. Открытие вакцинации. Работы Э. Дженнера.

Идея предотвращения заражения человека натуральной оспой с помощью прививки оспы коров пришла на ум Эдварду Дженнеру под влиянием разговора с пожилой крестьянкой, имевшей кожные высыпания. На вопрос, не больна ли женщина натуральной оспой, та заявила, что этой болезни у нее не может быть, поскольку она уже переболела "коровьей" оспой. Это поразило Дженнера и навело его на мысль о возможности практического использования коровьей оспы в профилактических целях.
За 30 лет Дженнер собрал все случаи заболевания человеком коровьей оспой в округе Глостершир в Англии (где он родился в 1749 году), и изучил клинику болезни. Уже в 1788 году он был убежден, что вакцина, т.е. содержимое оспенных пустул больных коровьей оспой (от лат. vacca - корова), будучи инокулированной человеку, надежно защищает его от натуральной оспы и что такая форма искусственного заражения - безвредный способ предотвращения тяжелой болезни, которой является оспа. Но только через 8 лет Дженнер опубликовал свои выводы. А в 1796 году он провел первый успешный эксперимент по вакцинации коровьей оспой. Свои результаты Дженнер изложил в статье "Исследование причин и действия коровьей оспы".
Дженнеру принадлежит теоретическое обоснование перекрестной специфичности человеческой и коровьей оспы и перекрестного иммунитета.
За открытие вакцинации в 1802 году британский парламент наградил Дженнера премией в
10 000 шиллингов. В 1808 году Дженнер принял участие в создании Национальной программы по вакцинации, которую по праву можно считать первой в истории социальной программой по иммунной профилактике населения.

1.4. Рождение экспериментальной иммунологии. Луи Пастер и Роберт Кох.

Дальнейший прогресс в области исследованя иммунитета к инфекционным болезням пришелся на последнюю четверть XIX века.
В 70-х годах прошлого столетия все большее распространение стала получать теория о микробах как возбудителях болезней. Техническое перевооружение биологии и медицины, активное использование микроскопической техники позволило экспериментально укрепить позиции концепции "живого контагия" в качестве причинного фактора при инфенционных болезнях. Были получены экспериментальные доказательства причинно-следственных отношений: инфекционная болезнь - специфический микроорганизм (Я. Генле, Ф.Ю. Кон, К.Д. Давен, Р. Кох, Л. Пастер).
Луи Пастер родился 27 декабря 18822 г. в г. Доле (Франция). Пастер занимался стереохимией, в частности он открыл явление молекулярной диссеметрии в строении органических веществ - явление, играющее важную роль в жизненных процессах. В 1857 - 1861 годах он доказал участие микроорганизмов в процессах гниения и брожения, а так же представил убедительные доказательства невозможности спонтанного зарождения микробов. По Пастеру, возбудители возникают не путем самопроизвольного зарождения, а воспроизводятся из себе подобных и являются этиологическими факторами конкретных и воспроизводимых форм. Пастер, развивая свои великолепные исследования о природе и способах предотвращения болезни шелковичных червей, а также болезней вина и пива, вступил в борьбу, чтобы убедить ученый мир в правильности своей теории возбудителя. Его сообщение в 1880 году о возможности профилактической иммунизации против куриной холеры знаменует возникновение научной иммунологии. Пастер показал, что с помощью ослабленного штамма куриной холеры можно создать приобретенный иммунитет к этому заболеванию. Исходя из своих наблюдений над иммунитетом, он, с его богатым воображением и некоторыми познаниями о кинетике роста бактерий в культуре, предложил свое собственное объяснение приобретенного иммунитета. Зная, что рост бактерий in vitro после начальной логарифмической фазы размножения быстро прекращается, Пастер связал это с истощением в среде тех специфических веществ, которые нужны для роста бактерий данного вида. Пастер предположил, что при заражении или при введении живой вакцины в организме происходит быстрое истощение тех уникальных питательных веществ, которые нужны для поддержания роста возбудителя инфекции. При отсутствии этих необходимых веществ второе заражение тем же самым возбудителем не сможет вызвать заболевания, и приобретенный иммунитет будет сохраняться в организме до тех пор, пока эти вещества не образуются вновь. Однако вскоре Теобальд Смит показал, что вакциной могут служить и убитые микробы, а Эмиль Беринг и Шибасабуро Китазато обнаружили, что даже надосадочная жидкость из бульонных культур возбудителей дифтерии и столбняка может вызывать иммунитет. Эти открытия наглядно показали несостоятельность предположенной Пастером теории истощения.
Роберт Кох (1843 - 1910) был первым, кто выделил и изучил возбудителя сибирской язвы, а затем он и Пастер вступили в продолжительный и временами ожесточенный спор об этиологии, патогенезе и профилактике сибирской язвы. И в конце концов именно Пастер продемонстрировал эффективный подход к иммунизации против сибирской язвы в своих знаменитых опытах на коровах, которые были проведены в 1881 году в Пуйиле-Фор на глазах у представителей международной прессы. Убедительная демонстрация эффективности предупредительных прививок аттенуированными микробами - и даже, как было показано позже, убитыми бактериями, - казалось, открывало перспективу получения аналогичных средств профилактики для любой инфекционной болезни, возбудитель которой удалось выделить. К числу таких болезней относилось большинство наиболее смертоносных заболеваний.

1.5. Иммунизация и сывороточная терапия. Введение понятий антиген - антитело.

На протяжении 80-90-х годов прошлого столетия осуществимость профилактической иммунизации была доказана для целого ряда инфекционных заболеваний. Однако попытки применить эти новые иммунологические подходы ко всем болезням принесли во многих случаях отрицательный результат. В частности, некоторые возбудители, позднее названные вирусами и риккетсиями, было невозможно выделить существовавшими тогда методами. В других случаях, как, например, при поражении Treponema pallidium, вызывающей сифилис, хотя возбудитель и мог быть обнаружен при гистопатологическом исследовании, вырастить его на искусственной питательной среде для приготовления вакцины не удавалось. И, наконец, были такие заболевания, как дифтерия и туберкулез, при которых сам возбудитель можно было вырастить и использовать для иммунизации, но это не обеспечивало защиты от инфекции, а иммунизация микробами типа холерного вибриона для профилактики холеры у человека оказалась малопригодной.
Значительный успех был достигнут и 1888 г., когда Эмиль Ру и Александр Йерсен сумели выделить растворимый токсин из надосадочной жидкости культур дифтерийной палочки. Этот токсин при введение экспериментальным животным вызывал всю картину дифтерии; стало очевидным, что по крайней мере иногда болезнь вызывает не сам микроб как таковой, а вырабатываемый им экзотоксин. После этого понадобилось немного времени, чтобы Эмиль фон Беринг (1854 - 1917) и его сотрудник Китасато развили эти наблюдения, и в 1890 г. они сообщили, что после иммунизации дифтерийным или столбнячным токсином в крови животных появляется нечто, способное нейтрализовать или разрушить токсин и тем самым предотвратить заболевание. Антитоксические сыворотки животных вскоре испытали на больных детях. Эффект был поразительным. Дети быстро выздоравливали, особенно если сыворотка вводилась на ранних сроках заболевания. Вещество, которое вызывало обезвреживание токсина, получило название антитоксина, а вскоре для обозначения этого нового класса веществ был введен более общий и менее обязывающий термин - антитело. То, что вызывает образование этих антител стали называть антигеном.
Данные фон Беринга об эффективности терапевтического применения антитоксина сразу же убедили медицинский мир, а всеобщий характер этого явления был подтвержден наблюдениями Пауля Эрлиха (1854 - 1915), который показал, что иммунизация животных токсинами растительного происхождения - рицином и абрином - также приводит к образованию нейтрализующих антитоксинов. Аналогичные токсины стали искать при других инфекционных заболеваниях, но вскоре было установлено, что этот новый терапевтический подход эффективен в основном при двух заболеваниях, для которых он был описан вначале.
Поиск новых и более совершенных вакцин против наиболее важных болезней человека и животных продолжался, хотя разработка часто задерживалась вплоть до выделения и идентификации соответствующего возбудителя или до появления новых методов его культивирования.

1.6. Изучение реакции антиген - антитело. Появление иммунохимии.

1.6.1. Теория Эрлиха

Было очевидно, что в антитоксических сыворотках содержатся особые вещества, которые способны специфически нейтрализовать токсический антиген, вызнавший их образование. Затем оказалось, что даже безобидные нетоксичные вещества вроде молока и различных других белков могут вызвать образование специфических антител, и стало ясно, что 'иммунный' ответ представляет собой феномен, который выходит далеко за границы антитоксического и антибактериального иммунитета. В 1896 г. Грубер и Дархэм открыли специфическую агглютинацию бактерий, а спустя несколько лет Жюль Борде - агглютинацию эритроцитов. В 1897 г. Крауз описал реакцию преципитации между антигеном и антителом. В результате появилась возможность проводить количественное и качественное изучение антител in vitro и практически наблюдать их действие. Но каким образом они образуются и как объяснить их строгую специфичность? Все эти вопросы поставил со свойственным ему богатым воображением Пауль Эрлих в своей классической статье о количественной оценке дифтерийных антисывороток (1897 г. "Измерение активности дифтерийной сыворотки и ее теоретические основы"). Эта публикация представляет большой исторический интерес с нескольких точек зрения. Во-первых, в ней была заложена основа для развития иммунохимии и определены пути для количественного изучения реакции антиген - антитело на последующие примерно 50 лет. Эрлих впервые ввел в иммунологическое исследование статистический метод - метод титрования антител и антигенов. Во-вторых, в статье декларировалось, что специфичность антител и их реакции опираются на законы структурной химии. В-третьих, в ней была предложена теория образования антител, оказавшая сильное влияние на иммунологическое мышление в течение многих последующих лет.
Непосредственная практическая сторона исследований Эрлиха состояла в том, что в них было показано, как следует проводить количественное определение дифтерийного токсина и антитоксина, что позволило создать рациональную основу для важной в те годы иммунотерапии. При этом Эрлих ввел в молодую область иммунологии множество терминов, которые стали потом общепринятыми. Он утверждал, что антитело - это самостоятельный вид молекул, существующих вначале в виде рецепторов (боковых цепей) на поверхности клеток и обладающих особой химической конформацией, которая обеспечивает специфическое взаимодействие с комплементарной конфигурацией на молекуле антигена. Он полагал, что как у антигена, так и у антител имеются функциональные домены, каждый из которых обладает гаптофорной группировкой, обеспечивающей химическое взаимодействие в результате взаимного соответствия по типу 'замка и ключа', т. е. аналогично взаимодействию фермент - субстрат, которое такой образной метафорой охарактеризовал Эмиль Фишер. Антигенная молекула токсина имеет также отдельную токсофорную группировку, разрушение которой превращает ее в токсоид, сохраняющий способность к специфическому взаимодействию с антителом. Эрлих установил единицы для количественного определения токсина и антитоксина и полагал, что валентность последнего равна примерно 200. В связи с вариабельностью кривых титрования для различных препаратов токсина Эрлих предположил, что они представляют собой смесь не только токсина и токсоида, но и других веществ с различным сродством к антительному рецептору. Принималось также, что молекула антитела имеет различные домены, один из которых отвечает за присоединение к антигену, а другие обеспечивают такие вторичные биологические явления, как агглютинация, преципитация и связывание комплемента. На протяжении нескольких десятилетий антитела с разной биологической активностью считали различными видами молекул, пока не восторжествовала унитарная теория Ганса Цинсера , согласно которой одно и то же антитело может обусловливать разнообразные биологические эффекты.
Эрлиховская теория взаимодействия антиген-антитело основывалась на положениях структурной органической химии тех дней. Эрлих не только полагал, что специфичность антитела зависит от химического состава и конфигурации молекулы, но считал взаимодействие антигена с антителом необратимой реакцией, основанной на образовании прочных химических связей определенного типа, названных позднее ковалентными. Это встретило решительные возражения со стороны Борде , а позднее Карла Ландштейнера и других, которые утверждали, что иммунологическое взаимодействие связано не с химическими, а скорее с физическими свойствами реагирующих макромолекул, и их взаимодействие, как и сама иммунологическая специфичность, лучше объясняется с точки зрения процессов 'коллоидальной' адсорбции. Они полагали, что на самом деле взаимодействие антиген-антитело является частично обратимым и в подтверждение этого указывали на феномен Даниша. Даниш показал, что степень нейтрализации дифтерийного токсина антитоксином зависит от того, как добавлять токсин - сразу или постепенно, а это значит, что реакция не обязательно имеет необратимый характер. Эта дискуссия между сторонниками химической и физической теорий взаимодействия антиген-антитело бушевала на протяжении многих лет и составила интересную главу в истории иммунологических представлений. В конечном итоге химическая концепция Эрлиха была в основном подтверждена, за исключением его утверждения, что связывание антигена антителом основано на образовании необратимой химической связи.
Подобная же дискуссия возникли между Эрлихом и Борде по поводу природы и способа фиксации комплемента комплексами антиген-антитело. Эрлих предполагал, что имеется множество комплементов, каждый из которых связывается со своим собственным рецептором на молекуле антитела, подобно тому как разные антигены специфически реагируют с соответствующими участками антитела. В противоположность этому Борде утверждал, что связывание антигена антителом (которое он называл 'сенсибилизирующим веществом") приводит к такому изменению конфигурации последнего, которое обеспечивает неспецифическое связывание одного и того же комплемента. Теория Борде в конечном счете оказалась правильной.
В центре внимания оказалась также природа взаимодействия антиген - антитело. По мнению Сванте Аррениуса и Торвальда Мадсена, взаимодействие токсин - антитоксин в высокой степени обратимо и напоминает нейтрализацию слабой кислоты слабой щелочью. Эта идея получила дальнейшее развитие в написанной Аррениусом в 1907 г. книге 'Иммунохимия', которая дала название новому разделу иммунологии. Соответственно Эрлиху эти исследователи утверждали, что взаимодействие антиген-антитело является строго стехиометрическим и подчиняется закону действующих масс. Однако вскоре было обнаружено, что соотношение между антигеном и антителами, которые участвуют в реакции, может сильно варьировать, и наконец в конце двадцатых и начале тридцатых годов Марак и Гейдельбергер выдвинули положение о том, что антиген и антитела являются мультивалентными и поэтому могут образовывать 'решетку', содержащую антиген и антитела в разных пропорциях.

1.6.2. Иммунодиагностика

 Уже вскоре после открытия в 1896 г. бактериальной агглютинации стало очевидным, что эта реакция дает в руки бактериолога мощный инструмент исследования. С ее помощью можно не только идентифицировать бактерии и дифференцировать их по агглютинации с соответствующими антисыворотками, но можно исследовать сыворотку больных на способность агглютинировать данный микроб и выяснить, был ли у человека контакт с этим микробом и какова у данного человека степень иммунитета к инфекции. Открытие реакции преципитации еще больше расширило возможности такой оценки, позволив определять антигены и антитела в таких системах, которые содержат растворимые продукты бактерий и даже вещества небактериальной природы. Пожалуй, никто не применил этот метод с такой элегантностью, как Г. Наттолл, который, исследовав специфические и перекрестные реакции антисывороток против сывороток животных и против растворимых белков, продемонстрировал, что иммунология может быть с успехом использована для изучения таксономических взаимоотношений и даже в судебной медицине.
Работы Борде, показавшего что антиэритроцитарные антитела и комплемент могут вызвать иммунный гемолиз, а компоненты реакции поддаются количественному определению, открыли новый подход к диагностике заболеваний. Теперь стало возможным определять в крови больных даже такие антитела, которые неспособны вызывать агглютинацию или преципитацию соответствующих антигенов и таким способом не только выявлять сам факт контакта с возбудителем, но и прослеживать серологически течение болезни. Этот подход блестяще использовал Август фон Вассерман и его сотрудники, разработавшие метод серодиагностики сифилиса в реакции связывания комплемента. Вскоре после этого было предложено еще много других способов применения реакции связывания комплемента для качественного и количественного анализа как антител, так и антигенов.

1.6.3. Аутоиммунитет

Когда в 90-х годах прошлого столетия осознали, что вызвать образование антител можно даже с помощью веществ небактериальной природы типа растительных и сывороточных белков или эритроцитов, то для получения специфических антител стали вводить экспериментальным животным чуть ли не все мыслимые вещества, какие только попадались в руки иммунологам. Животных иммунизировали не только веществами чужеродного происхождения, но также неизменными компонентами своего собственного организма. В ранних работах с введением животному собственной сыворотки и других жидкостей организма неизменно получались отрицательные результаты, и это позволило Эрлиху сформулировать его знаменитое выражение: страх самоотравления, согласно которому по неизвестным причинам организм не способен к иммунному ответу против собственных компонентов. Однако другие исследователи не ограничивались изучением одних только растворимых веществ, и вскоре Илья Мечников (1845 - 1916 гг.) и другие показали, что иммунизация животных их собственными сперматозоидами и клетками многих других органов ведет к образованию антител с цитотоксическими свойствами в отношении вводившихся клеток и часто специфичных к тому органу, из которого получены клетки. Этим было положено начало изучению феноменов аутоаллергии, при которых механизмы протективного иммунитета могут парадоксальным образом обратиться против человека, включаясь в пагубную для него реакцию, направленную против собственных элементов организма.

1.7. Теории клеточного и гуморального иммунитета.

Историкам науки хорошо известно, что периоды наиболее значительного прогресса в какой-либо области очень часто бывают отмечены дискуссией между двумя противостоящими школами, каждая из которых стремится провести эксперименты, подтверждающие ее собственную точку зрения и опровергающие противоположный взгляд. Так в ранний период развития иммунологии такие споры возникали вокруг природы взаимодействия антиген- антитело и способа действия комплемента, и именно в этом был заключен важный стимул для быстрого развития иммунологических знаний. Но, пожалуй, ни один спор не был таким долгим и не имел таких важных последствий для дальнейшего развития иммунологии, как спор между приверженцами клеточной теории иммунитета и теми, кто считал гуморальные факторы единственной основой иммунологических процессов. Вместе с тем этот иммунологический диспут не был изолированным явлением; его следует рассматривать скорее как часть более широкой революции идей, которая происходила в медицине XIX в. и затронула самые основы понимания физиологических и патологических процессов. Более двух тысячелетий в медицине господствовали представления древнегреческих гуморалистов, видевших в болезни результат количественных и качественных нарушений равновесия главных жидкостей организма. Только в XIX в. было признано значение клеток, из которых состоят различные органы и которые образуют различные жидкости тела. Вирховской клеточной патологии (утверждающей, что в основе болезней лежит нарушение функции клеток) едва исполнилось 30 лет, когда иммунологам пришлось выбирать, чью сторону они займут в их собственном варианте этого большого конфликта.
Зоолог Илья Мечников был первым, кто четко сформулировал представление о важной роли лейкоцитов в защите организма от инфекционных заболеваний, которая реализуется благодаря их способности и фагоцитозу (1884 г.). Это свое положение Мечников аргументировал тем, что даже у морских беспозвоночных имеются макрофаги, способные поглощать и разрушать чужеродные вещества или внедрившиеся бактерии или по крайней мере изолировать их с помощью грануломатозных реакций или образования гигантских клеток. Мечников полагал, что такую же защитную функцию несут фагоцитирующие клетки позвоночных, являющиеся наиболее важными участниками и естественного, и приобретенного иммунитета. Эта работа произвела глубокое впечатление на Пастера, и он пригласил Мечникова в свой недавно образованный Пастеровский институт в Париже, где Мечников с целым рядом выдающихся учеников провел следующие 28 лет в плодотворной и полной творческого воображения работе, стремясь подтвердить и расширить клеточную (фагоцитарную) теорию иммунитета.
Клеточная теория Мечникова сразу наткнулась на сопротивление. Прежде всего она была предложена в то время, когда большинство патологов видели в воспалительной реакции, а также в связанных с ней микрофагах и макрофагах не защитную, а вредоносную реакцию. В то время считали даже, что, хотя фагоцитирующие клетки действительно способны поглощать болезнетворные микроорганизмы, это приводит не к разрушению возбудителя, а к переносу его в другие части тела и распространению болезни. Позднее в 1888 г. Наттолл нашел в сыворотке нормальных животных вещества, токсичные для некоторых микроорганизмов, и показал, что такие антибактериальные свойства значительно повышаются в результате иммунизации животного. В дальнейшем было обнаружено, что в сыворотке имеются два разных вещества, совместное действие которых приводит к лизису бактерий: термостабильный фактор, затем идентифицированный как сывороточные антитела, и термолабильный фактор, названный комплементом или алексином (от греч. aleksein - защищать).
Сильный удар по клеточной теории иммунитета был нанесен открытием Беринга и Китасато, которые в 1890 г. показали, что иммунитет к дифтерии и столбняку явно основан на циркулирующих антителах, а не на фагоцитирующих клетках. Со временем были обнаружены циркулирующие антитела к большинству вновь открываемых патогенных микроорганизмов, количество которых быстро увеличивалось. Наконец ученик самого Мечникова Борде описал лизис эритроцитов гуморальными антителами и комплементом, и большинство исследователей стали соглашаться с Кохом, что победу одержали гуморалисты.
Несмотря на столь сильные аргументы против фагоцитарной теории, Мечников и его ученики отнюдь не собирались сдаваться. Были поставлены простые опыты, в которых микробы, помещенные в маленький мешочек из фильтровальной бумаги, защищающий их от фагоцитов, сохраняли свою вирулентность, хотя буквально купались в тканевой жидкости, богатой антителами. Это был прообраз неспецифической иммунотерапии, применяемой в наши дни. Но в 90-е годы прошлого столетия общее настроение явно было не в пользу фагоцитарной теории, и попытка Мечникова восстановить престиж фагоцитоза публикацией в 1901 г. его знаменитой книги 'Иммунитет к инфекционным болезням' оказалась запоздалой. Книга вызвала всеобщее восхищение своей эрудицией, но из неверующих она убедила лишь немногих.
Большая часть иммунологов, за исключением самого Мечникова и его ближайших последователей, избрали предметом своих исследований антитела, которые легче определять количественно и с которыми проще работать, чем с клетками. Тем не менее в этот период времени было сделано две попытки примирить противоречия между гуморальным и клеточным направлениями. В 1908 г. Шведская академия удостоила Нобелевской премии по медицине совместно Мечникова - основателя клеточного направления и Эрлиха - олицетворявшего гуморалистские идеи того времени. Несколько ранее в Англии сэр Элмрот Райт и С. Р. Дуглас попытались примирить различия между этими двумя школами в своих капитальных исследованиях процесса опсонизации (от греч. opsonein - делать съедобным). Эти ученые утверждали, что клеточный и гуморальный факторы являются одинаково важными и взаимозависимыми в том отношении, что гуморальные антитела, специфически реагируя со своей мишенью - микроорганизмом, подготавливают его к фагоцитозу макрофагами.
Приверженность Райта этой идее была в Англии настолько известна, что его друг Бернард Шоу использовал это в качестве сюжета для своей пьесы 'Врач перед дилеммой'. Этой едкой насмешке над деятелями медицинской профессии Шоу предпослал 'Предисловие о докторах', в котором выразил взгляды Райта следующим образом: 'Следуя одной из самых плодотворных биологических фантазий Мечникова, сэр Элмрот Райт обнаружил, что белые кровяные шарики, или фагоциты, которые атакуют и пожирают возбудителей наших болезней, делают это лишь в том случае, если мы для аппетита намажем этих возбудителей естественным соусом, который сэр Элмрот назвал опсонином'. Однако предложенные Райтом опсонический индекс и терапевтические подходы вскоре вышли из употребления отчасти из-за того, что сами методы были слишком сложными для применения, а получаемые результаты было трудно воспроизвести. Старания Райта оживить клеточную теорию иммунитета не оказали значительного влияния на дальнейшее развитие иммунологии.

1.8. Теории образования антител

Вначале в термин антитело не вкладывалось какого-то определенного смысла. Этим словом обозначали любое начало, присутствовавшее в иммунной сыворотке и способное нейтрализовать токсины и патогенные бактерии. Однако возможность пассивного переноса иммунитета с помощью сыворотки показала, что антитела должны быть особым веществом, которое каким-то образом возникает в иммунизированном организме. Механизм их образования сразу же явился предметом для теоретических построений и исследований. Вначале возникла вполне правдоподобная версия, что информацию, определяющую специфичность антител, несет сам антиген, который каким-то образом включается в молекулу антитела и придает ей способность специфически реагировать с другими молекулами антигена, имеющими сходное строение. Эта теория не смогла просуществовать долго, потому что уже ранние количественные исследования показали, что в организме образуется значительно больше антител, чем это может быть обусловлено количеством введенного антигена, а сам процесс образования антител, единожды начавшись, продолжается без дополнительных инъекций антигена. И наконец, в 1897 г. Пауль Эрлих предложил всеобъемлющую теорию образования антител, которая сначала была дополнением к его выдающимся работам по количественному определению дифтерийного токсина и антитоксина, а затем была детально разработана самим Эрлихом и его учениками.

1.8.1. Теория боковых цепей Эрлиха

 Эрлих полагал, что антитела представляют собой макромолекулы, специфичность которых для антигена и комплемента зависит от присутствия определенных стереохимических конфигураций, обладающих комплементарностью к аналогичным структурам антигена, что обеспечивает специфическое взаимодействие между ними. По его мнению, антитела - это естественный компонент организма, играющий роль специфического рецептора поверхностной мембраны клеток, где они выполняют в норме такие же физиологические функции, как гипотетические рецепторы для питательных веществ или как рецепторы для лекарственных препаратов, существование которых утверждал Эрлих в своих более поздних теориях химиотерапии. Один из постулатов Эрлиха заключался в том, что антиген специфически отбирает соответствующие антительные рецепторы, отрывающиеся затем от поверхности клеток. Это приводит к конденсаторной гиперпродукции рецепторов, которые накапливаются в крови в виде циркулирующих антител. Блестящая теория, предложенная Эрлихом, оказала глубокое и длительное влияние и - особенно в Германии - определила развитие идей в самых разных областях медицины. Однако в последующие десятилетия в иммунологии произошли два события, бросившие тень сомнения на теорию Эрлиха. Первым из них был целый поток исследований, показавших, что антитела можно получить против огромного количества разнообразных вполне безвредных природных веществ. Кроме того, в двадцатые годы появились, данные Ф. Обермайера и Е. П. Пика , значительно развитые затем Карлом Ландштейнером, согласно которым антитела могут образовываться против почти любого искусственного химического соединения, если его присоединить в качестве гаптена к белку-носителю. После этого стало казаться невероятным, чтобы организм мог вырабатывать специфические антитела против такого огромного количества чужеродных и даже искусственно созданных структур.

1.8.2. Инструктивные теории образования антител

Вполне естественно, что в тот период времени, когда так мало было известно о структуре белков и еще меньше о пути их образования, все были под впечатлением широты иммунологического репертуара и разнообразия химических структур, способных вызвать их образование. Именно это и привлекало внимание к антигену как носителю иммунологической информации. Сложилось убеждение, что именно антиген управляет образованием специфических антител, направляя механизмы белкового синтеза на изготовление тех уникальных молекулярных конфигураций, которые определяют иммунологическую специфичность. Тем или иным способом антиген должен передать новообразованной молекуле белка информацию о своей специфичности, чтобы придать этой молекуле функции антитела. Наиболее известная из этих инструктивных теории, созданная в 1930 г. Ф. Брейнлем и Ф. Гауровицем, утверждала, что антиген играет роль матрицы, которая обеспечивает сборку уникальных аминокислотных последовательностей полипептидной цепи антител. Позднее инструктивная теория была развита Лаинусом Полингом, поддержавшим ее всем авторитетом, которым он пользовался в области физической химий. Утверждалось, что антиген может служить тем шаблоном, на котором происходит свертывание предобразованной полипептидной цепи с возникновением соответствующей третичной конфигурации, заключающей в себе стереохимическую специфичность. В течение нескольких десятилетий подобные теории прямой матрицы пользовались большой популярностью, так как казалось, что они предлагают единственное разумное объяснение тому многообразию антител, которое, как показали Ландштейнер и другие, может образовываться в организме позвоночных.
С точки зрения биолога, теории матрицы обладали значительными недостатками, и именно это привело вирусолога Макфарлейна Бернета к созданию в 1941 г. другого варианта инструкционистской теории. В условиях растущего признания той роли, которую ферменты играют в процессах синтеза и расщепления, Вернет предположил, что функция антигена может заключаться в том, что он стимулирует адаптивную модификацию тех ферментов, которые необходимы для синтеза глобулина, вызывая в результате образование уникальной белковой молекулы с нужной специфичностью. Эта теория адаптивных ферментов имела то преимущество, что с позиций первичной инструктивной роли антигена она объясняла не только широту иммунологического репертуара, но и длительное образование антител и усиленный вторичный иммунный ответ.
С развитием представлений о возможной генетической роли нуклеиновых кислот Вернет и Франк Феннер в 1949 г. модифицировали эту теорию. Они предположили, что антиген может вносить информацию о своей специфической детерминанте прямо в геном. Это приводит затем к образованию непрямой матрицы для специфических антител.

1.8.3. Селективные теории образования антител

 Первую, чисто биологическую, селективную теорию образования антител сформулировал в 1955 г. Нильс Ерне, который назвал ее теорией 'естественного отбора'. Ерне, как и раньше Пауль Эрлих, предположил, что в организме действительно синтезируется полный набор антител, но каждое из них образуется в небольшом количестве и независимо от какого-либо стимула поступает в кровь в виде 'естественных антител'. Функция этих антител должна состоять в том, чтобы избирательно связываться с антигеном и таким способом доставлять этот антиген неким клеткам организма, для которых антитела служат сигналом к воспроизведению таких же молекул, т. е, к образованию большого количества специфических антител.
Теория естественного отбора, предложенная Ерне, привлекла на свою сторону лишь немного приверженцев инструктивных теорий, однако она имела большое историческое значение, так как дала стимул для теоретиков биологического направления. Действие этого стимула проявилось очень скоро, когда на протяжении трех лет Вернет, Дэвид Толмедж и Джошуа Ледерберг создали клонально-селекционную теорию образования антител. Основа этой концепции заключается в том, что антитела представляют собой естественный продукт, присутствующий на поверхности клеток в качестве рецептора, с которым антиген может вступать в избирательное (селективное) взаимодействие. Это взаимодействие служит сигналом для клональной пролиферации популяции клеток, которые фенотипически отличаются от остальных тем, что специфичны именно к данному антигену. Среди дочерних клеток клона часть дифференцируется в сторону антител образующих клеток, а остальные сохраняются в качестве клеток иммунологической памяти, которые могут в последующем обеспечить усиленный вторичный ответ.

Часть 2. Нобелевские лауреаты в иммунологии

1901

Первой Нобелевской премии по медицине был удостоен Эмиль фон Беринг (1854 - 1917). Свои исследования он проводил у Роберта Коха в Кохонском институте в Берлине. Беринг со своими сотрудниками Китасато и Вернике в 90-92 гг. прошлого столетия показали, что иммунитет к дифтерии и столбняку зависит от образования антитоксинов, циркулирующих в крови. Он показал, что пассивное введение антитоксической сыворотки может обеспечить выздоровление больных, и этим положил начало сывороточной иммунотерапии разнообразных болезней. Премия была присуждена ему 'за его исследования по сывороточной терапии, и, в частности, за применение ее против дифтерии, в результате чего он открыл новый путь в области медицинской науки и дал в руки врача победоносное оружие против болезни и смерти'.

1905

Премия присуждена Роберту Коху (1843-1910, Германия) 'за его исследования и открытия, связанные с туберкулезом'. Иммунодиагностика с помощью туберкулинового теста и 'феномен Коха', который состоит в повышенной кожной реакции на туберкулезные бациллы при введении их в кожу сенсибилизированных животных, сыграли решающую роль в изучении механизмов клеточного иммунитета.

1908

Премию этого года разделили Илья Мечников (1845-1916, Россия) и Пауль Эрлих (1854-1915, Германия), получившие ее в качестве 'признания их работ по иммунитету'.

1913

Премия присуждена Шарлю Рише (1850-1935, Франция) 'за исследования по анафилаксии'. Вместе со своим коллегой Полем Портье он открыл феномен анафилаксии, обусловленный не токсическими свойствами вводимых веществ, а их действием как антигенов в предварительно сенсибилизированном организме. Тем самым он открыл новое и в то время весьма неожиданное направление в медицине, показав, что 'защитные' механизмы иммунитета могут также вызывать развитие болезни.

1919

Премия присуждена Жюлю Борде (1870-1961, Бельгия) 'за его исследования по иммунитету'. В 1898 г. он открыл феномен специфического гемолиза. Спустя некоторое время, работая вместе со своим помощником Октавом Жангу, Борде описал феномен фиксации комплемента и диагностические возможности этой реакции.

1930

Премии удостоен Карл Ландштейнер (1868-1943, Австрия) 'за открытие групп крови у человека'. В своих исследованиях по аптиэритроцитарным антителам он описал в 1901 г. ряд изогемагглютининов человека, которые к наше время составляют систему групп крови АВО. В 1926 г. Ландштейнер и Филип Левин открыли систему МNР, а в 1940 г. вместе с Альбертом Винером - систему групп крови Rf. Ландштейнер внес весьма значительный вклад в понимание химических основ взаимодействия между антителами и антигеном, обобщив наблюдения в своей знаменитой книге 'Специфичность серологических реакций'. Отдавая должное значение своему открытию групп крови, Ландштейнер заметил, что, с его точки зрения, премию 1930 г. следовало бы скорее присудить за его исследования по взаимодействию гаптен - антитело.

1951

Премия присуждена Максу Тейлеру (1899- ) 'за разработку вакцины против желтой лихорадки'. Тейлер родился в Южной Африке, изучал медицину в Англии и затем в 1922 г. переехал в Соединенные Штаты. Именно он показал, что возбудителем желтой лихорадки является фильтрующийся вирус, и описанный им тест защиты мышей (при котором сывороточные антитела в смеси с ви-русом защищают мышь от гибели при внутримозговом заражении) стал весьма нажным инструментом в эпидемиологических и других исследованиях желтой лихорадки. В конце 30-х годов ему удалось получить аттенуированные штаммы, которые сохраняли свою иммуногенность, но были лишены патоген-ности и составили основу современных эффективных вакцин против желтой лихорадки.

1957

Премия присуждена Даниэлю Бове (1907- , Швейцария), 'за разработку антигистаминных препаратов для лечения аллергии'. Открытие феномена Шульца - Дейла (сокращение кусочка матки под влиянием антигена) позволило моделировать in vitro аллергические реакции и изучать участвующие в них физиологические механизмы. В результате этого было обнаружено, что среди факторов, которые освобеждаются при анафилаксии, наиболее важными являются гистамин, серотонин и другие биологически активные вещества. Бове, по-видимому, познакомился с иммунологией и аллергией в период своей работы в Пастеровском институте в Париже, когда он опубликовал много работ о действии различных химических соединений на вегетативную нервную систему. Эти исследования привели его к поиску веществ, способных подавлять действие гистамина; в результате появились лекарственные препараты, оказавшиеся эффективным средством лечения астмы и сенной лихорадки.

1960

Премия присуждена Ф. Макфарлейну Бернету (1899 - 1985) и Питеру Медавару (1915 - , Англия) 'за открытие приобретенной иммунолотической толерантности'. Медавар показал, что отторжение чужеродного кожного трансплантанта подчиняется всем правилам иммунологической специфичности и в основе его лежат такие же механизмы, как и при защите от бактериальных и вирусных инфекций. Последующая работа, которую он провел вместе с рядом учеников, заложила прочную основу для развития трансплантационной иммунобиологии, которая стала важной научной дисциплиной и в дальнейшем обеспечила многие достижения в области клинической трансплантации органов. Бернет опубликовал книгу 'Образование антител' (1941 г.). Со своим коллегой, Франком Феннером, Бернет утверждал, что способность к иммунологическим реакциям возникает на сравнительно поздних стадиям эмбрионального развития и при этом происходит запоминание существующих маркеров 'своего' у антигенов, присутствующих в данный момент. Организм в последующем приобретает к ним толерантность и не способен отвечать на них иммунологической реакцией. Все антигены, которые не запомнились, будут восприниматься как 'не свои' и смогут в дальнейшем вызывать иммунологиче-ский ответ. Было высказано предположение, что любой антиген, введенный в течение этого критического периода развития, будет затем восприниматься как свой и вызывать толерантность, в результате чего не сможет в дальнейшем активировать иммунную систему. Эти идеи были далее развиты Бернетом в его клонально-селекционной теории образования антител. Предположения Бернета и Феннера были подвергнуты экспериментальной проверке в исследованиях Медавара, который в 1953 г. на мышах чистых линий получили четкое подтверждение гипотезы Бернета - Феннера, описав феномен, которому Медавар дал название приобретенной иммунологической толерантности.

1972

Премия присуждена Роднею Р. Портеру (1917-1985, Англия, Оксфорд) и Джералду М. Эдельману (1929- ,Рокфеллеровский университет) 'за их исследования по химической структуре антител'. Данные А. Тизелиуса и Э. А. Кэбета о том, что антитела являются гамма-глобулинамп с большой молекулярной массой, показали, насколько трудным будет установить химическую основу для их первичной иммунологической специфичности и их вторичных биологических свойств. Расщепляя молекулу антитела ферментами, Портер стремился получить более мелкие активные фрагменты, и в 1958 г. он добился успеха. При расщеплении папаином из молекулы антитела удалось выделить три составляющие ее фрагмента: два идентичных Fab-фрагмента и третий Fc-фрагмент. Fab-фрагмент содержит антительные участки связывания антигена, а Fc обеcпечивает вторичную биологическую активность антитела. Затем Эдельман показал, что, восстанавливая гомогенный миеломпый белок, можно выделить составляющие его полипептидные цепи - легкие (L) и тяжелые (H). Далее Портер показал, что молекула иммуноглобулина образована двумя легкими и двумя тяжелыми цепями. На основе этих данных была создана теперь уже общепризнанная модель строения IgG. Выделение из иммуноглобулина цепей и фрагментов открыло возможность изучения их аминокислотной последовательности; такие исследования стали проводиться с большой интенсивностью в лабораториях Портера, Эдельмана и многих других исследователей. В результате этих работ было установлено, что в L- и H-цепях существуют как вариабельные, так и константные области, и появилась возможность сравнивать первичную структуру антител разной специфичности, и даже разных видов животных. Наконец в 1969 г. Эдельман и его сотрудники сумели расшифровать полностью первичную структуру одной молекулы иммуноглобулина, что позволило не только установить положение антиген-связывающего участка, но также локализовать те 'домены', которые обеспечивают вторичные биологические функции антител.

1977

Премия по медицине присуждена Р. Йалоу (рожд. 1921, США) 'за разработку метода радиоиммунологического анализа пептидных гормонов'.

1980

Премия по медицине присуждена Баруху Бенацеррафу (1920, Венесуэла), Жану Доссе (1916, Франция) и Джорджу Снеллу (1903, США) 'за их работу по генетически детерминированным структурам клеточной поверхности, регулирующим иммунологические реакции'. В 1965 г. Доссе и его сотрудники описали систему примерно из 10 антигенов человека, закодированных в главном комплексе гистосовместимости, который включает 'сублокусы', определяющие ограниченное число антигенных аллелей.

1984

Нобелевская премия по медицине присуждена Нильсу К. Йерне (1911-1994, Дания), Джорджесу Кехлеру (1946-1995, Германия) и Сезару Милштейну (1927, Аргентина) 'за теории, касающиеся специфичности в иммуной системе и открытие принципов получения моноклональных антител'.

1987

Премия по медицине присуждена Сусумо Тонегава (1939, Япония) 'за открытие генетических принципов генерации антител'.

1996

Премия по медицине присуждена Питеру Доэрти (1940, Австралия) и Рольфу Зинкернагелю (1944, Швейцария) 'за их открытия в области специфичности клеточного иммунного ответа'. Оба работают в США.

Часть 3. Современная иммунохимия.


Классические методы иммунохимического анализа, описанные еще в конце XIX веке в работах таких выдающихся ученых как Эрлих, Борде, Ландштейнера основаны на образовании антителами в присутствии антигена преципитата (осадка), однако для визуальной регистрации процесса преципитации необходимы высокие концентрации компонентов и длительное время проведения реакции. Результаты такого анализа не всегда можно однозначно интерпретировать и, кроме того, в большинстве случаев они носят качественный или полуколичественный характер. Кроме того, для многих одновалентных антигенов (гаптенов), например гормонов, лекарственных соединений, эти методы непригодны.
Индикация образовавшегося комплекса антиген - антитело в растворе может быть осуществлена, если в один из исходных компонентов реакционной системы ввести метку, которая легко детектируется соответствующим высокочувствительным физико-химическим методом. Весьма удобными для этой цели оказались изотопные, ферментные, флуоресцентные, парамагнитные метки, использование которых дало возможность увеличить чувствительность иммунохимических методов в миллионы раз, а время анализа уменьшить до нескольких часов.
Новые иммунохимические методы, основанные на применении меченых реагентов, нашли широкое распространение для количественного определения биологически активных соединений самой разнообразной структуры - от низкомолекулярных гормонов до высокомолекулярных вирусов и целых клеток.
Наибольшее развитие среди них получил радиоиммунологический анализ (РИА), предложенный в конце 50-х годов. Благодаря возможности определять метку, которой являлся изотоп 125I , в очень малых концентрациях, удалось достигнуть высокой чувствительности анализа (на уровне пкг/мл). Разработка РИА явилась поворотным моментом в развитии иммунохимических методов анализа, положившим начало целой серии методов с использованием различных меченых соединений. За разработку метода его авторы Р. Йалоу и С. Берсон(Yalow and Berson) в 1977 г. были удостоены Нобелевской премии. Существуют разные варианты радиоиммуноанализа. Так, например, Майлес и Халес (Miles and Hales) в 1968 году использовали йодированные антитела в комбинации с антигеном на твердой фазе. В1978 году Лангон (Langone) предложил метить йодом белок А, который способен специфично связываться с Fc фрагментами антител. Таким образом, меченый белок А можно использовать как универсальный реагент. В 1979 Вейлером и Зенком(Weiler and Zenk) был предложен авторадиографический РИА, в котором они использовали мультиканальные плашки. Кроме того, в 1981 Аксельсон с коллегами(Axelson) разработали липосомный иммуноанализ, где антиген включался в меченые йодом липидные визикулы, которые затем могли быть осаждены антителами.
Наряду с несомненными достоинствами РИА имеет и определенные недостатки, к которым можно отнести следующие: 1) ограниченный срок жизни радиоактивной метки, что вызывает необходимость постоянной замены реактивов; 2) относительно дорогое специальное оборудование для регистрации радиоактивности; 3) возможность радиоактивного заражения окружающей среды при осуществлении большого количества анализов, что вызывает необходимость соблюдения специальных мер предосторожности и высокой квалификации обслуживающего персонала. Именно эти трудности послужили исходным моментом для поиска методов, альтернативных РИА, но сохраняющих его высокую чувствительность, специфичность и экспрессность.
В середине 60-х годов для идентификации и локализации антигенов в гистохимических препаратах и выявления полос преципитации в иммунодиффузионных и иммуноэлектрофоретических методах в качестве высокочувствительной метки было предложено использовать молекулы ферментов. Являясь по своей природе мощными химическими катализаторами, ферменты способны эффективно осуществлять наработку легко детектируемого продукта, что делает возможным определение ферментной метки в весьма малых концентрациях (до 10-12 М и ниже). На протяжении последних двух десятилетий иммуноферментные методы анализа интенсивно развивались как в теоретическом, так и практическом плане и к настоящему времени они сформировались в самостоятельное научное направление, имеющее важное прикладное значение. Использование твердых носителей для сорбционной или ковалентной иммобилизации антител с последующим специфическим связыванием анализируемого соединения на иммуносорбенте и выявлением образовавшихся иммунокомплексов с помощью меченных ферментами компонентов положило начало методам твердофазного (гетерогенного) иммуноферментного анализа. Впервые такой анализ провели в 1971 году Энгвал и Перлман (Е. Engvall и P. Perlmann) для IgG фракции, Ван Веемен и Шурс (К Van Weemen и A. Schuurs) для эстрогенов (1971).
Эти методы наиболее распространенные и используются для определения широкого круга как низкомолекулярных, так и высокомолекулярных соединений - антител, пептидных и стероидных гормонов, фармакологических препаратов, вирусных и бактериальных антигенов, пестицидов и т. д.
В 1972 г. Рубенштейн с сотр. (К. Е. Rubenstein et al., 1972) разработали новый подход, заключающийся, в проведении всего анализа без использования твердой фазы. Метод получил название гомогенного ИФА и был основан на учете различий каталитических свойств ферментной метки в свободном виде и в иммунохимическом комплексе. В дальнейшем термин 'гомогенный иммуноанализ' стал применим к любой системе иммуноанализа, в которой специфическая реакция взаимодействия антигена с антителом и определение глубины ее протекания осуществляются в гомогенном растворе.
Отсутствие стадии разделения свободного и меченого анализируемого соединения привело к сокращению времени проведения анализа до нескольких минут. Это исключительно важное обстоятельство позволило разработать диагностические иммуноферментные тест-системы экспресс-определения биологически активных соединений, нашедшие широкое применение в химической токсикологии, фармакологии, эндокринологии.
Внедрение гомогенного мультиканального варианта ИФА, получившего название EMIT-анализа (Энгвал, 1980), в область клинической биохимии содействовало созданию высокочувствительных методов количественного определения гормонов, наркотических и лекарственных веществ в биологических жидкостях, что дало возможность изучить их фармакокинетику и метаболизм в организме. Большим преимуществом метода EMIT-анализа является возможность использования малых объемов анализируемого образца (5-50 мкл) и отсутствие стадии его предварительной обработки.
Развитие гомогенного ИФА начиналось с разработки методов определения низкомолекулярных соединений, затем появились новые модификации, позволяющие определять и высокомолекулярные антигены - альбумин, иммуноглобулины и т. д.
Еще один вариант иммуноанализа - флуоресцентный иммуноанализ (ФИА) c использование флуоресцентных меток. Впервые такой анализ провели Смит и Хеммина (Smith, 1981 and Hemmina, 1984). Потенциальная чувствительность флуорсцентных методов очень высока, но на практике она лимитируется сигналом фона, который может возникать из-за присутствия в растворе других флуорофоров. Существует огромное количество разновидностей ФИА - как гомогенных, так и гетерогенных [5, стр.86].
Наиболее удобным из гомегенных флуоресцентных методов оказался поляризационный ФИА, основанный на измерении поляризации флуоресценции. Так, после первых работ Вебера (Weber, 1952), применение поляризации флуоресценции для изучения биологических систем стало быстро внедрятся в иммуноанализ. Впервые поляризационно-флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА) был описан в работах Дандликера и Спесера (Dandliker and Spencer, 1973). Основан он на конкуренции определяемого антигена и антигена, меченого флуоресцентной меткой за ограниченое число центров связывания специфических антител и измерении степени поляризации флуоресценции реакционной смеси. Первым клиническим применением ПФИА было измерение гентамицина (Watson, 1976). В качестве метки использовался флуоресцеин изотиокарбонат (FITC). Кроме флуоресцентных существуют еще био- и хемилюминисцентные методы (Velan and Haimann, 1978).
Широкие возможности в ИФА открывает использование моноклональных антител, специфичных строго к определенному антигенному участку анализируемого соединения (1976 г. Kohler and Milstein, Нобелевская премия за получение моноклональных антител in vitro). Надо также отметить работы Лайнуса Полинга (1-я пол. XX в., США), которому удалось получить искусственные антитела. Кроме того, он сформулировал постулат о комплементарности трехмерной структуры антигена и антитела (1942).
Путем подбора соответствующих антител можно создавать довольно сложные иммунохимические системы, позволяющие идентифицировать соединения самого разнообразного круга.
Метод иммуноанализа находится в постоянном развитии. С одной стороны, расширяется число объектов исследования, с другой - углубляются и совершенствуются методы самого анализа. Это приводит к тому, что упрощается схема анализа, сокращается время его проведения, уменьшается расход реагентов. Идет постоянный поиск все новых и новых веществ, используемых в качестве маркеров. Все возрастающее влияние на ИА оказывают химия высокомолекулярных соединений, клеточная и генная инженерия, под влиянием которых меняются технологии получения реагентов для ИА.

Литература

 1. Иммунология т.1, под ред. У. Пола, Москва 'Мир' 1987.
2. Зарождение иммунологии, Т.И. Ульянкина, Москва 'Наука' 1994.
3.Теория и практика иммуноанализа, А.М. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова, Москва 'Высшая Школа' 1991.
4. Immunoassays Essential Data, edited by R. Edwards, NETRIA, St Brttholomew's Hospital, London, UK
5.Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology, volume 6, part 2, edited by R.H. Burbon and P.H. van Knippenberg
6. Complementary immunoassays, edited by W.P. Collins, John Wiles & Sons Ltd.