Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://kodomo.cmm.msu.ru/~julia270692/term7/1i6w.doc Дата изменения: Sun Dec 2 02:37:55 2012 Дата индексирования: Sun Feb 3 03:16:58 2013 Кодировка: koi8-r Поисковые слова: фазовый угол

Критический анализ белка липазы Bacillus subtilis,
представленной в банке PDB, код 1I6W
Нарайкина Ю.В.,4 курс ФББ МГУ

В отчете приведены результаты анализа качества структуры белка LipA,
расшифрованной методом РСА в 2001 году учёными из Голландии и Германии
(Gertie van Pouderoyen, Thorsten Eggert, Karl-Erich Jaeger, Bauke W.
Dijkstra) и содержащимся в PDB под кодом 1I6W.
Введение
Липаза Lip A из Bacillus subtilis относится к семейству I.4 бактериальных
липаз. Кристаллическая структура этого белка была расшифрована методом
рентгеноструктурного анализа с разрешением 1,5 е и стала первой в
семействе. Липаза имеет минимальную ?/? гидролазную укладку из 6
параллельных ?-тяжей, фланкированных 5 ?-спиралями. Каталитическая триада
Ser77, Asp133 и His156 и остатки, формирующие оксианионную впадину (амидные
группы остатков Ile12 и Met78) находятся в местах, схожих с таковыми в
липазах с известными структурами. Однако, по сравнению с большими липазами,
у Lip A гидрофильный Ser77 и отсутствует домен «крышка» (lid domain).Также
на основе сравнения с другими липазами, ковалентно связывающими
тетраэдрический интермедиат, была создана модель связывания субстрата
ферментом LipA. Она объясняет предпочтение липазой субстратов c C8-цепями
жирных кислот.
Ссылка на статью: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11491291
Выдача программы WHAT_CHECK: http://www.cmbi.ru.nl/pdbreport/i6/1i6w/

Результаты
I.Интегральная оценка качества
1. Липаза (LipA) имеет глобулярную структуру размером 35 е * 36 е * 42 е.
Комплекс состоит из одного домена, состоящий из 6 параллельных ?-
тяжей, окруженных ?-спиралями (две из них с одной стороны ?-листа, 3-
с другой). Фермент имеет минимальную ?/? укладку гидролаз вследствие
малого размера и отсутствия одного домена, по сравнению с другими
расшифрованными структурами липаз. Существует разница и между
элементами вторичной структуры: нет ?1, ?2-тяжей канонической
структуры, а также различается одна ?-спираль. Для кристаллизации в
модель был включен ион кадмия.
[pic]
2. Катализируемая реакция (PDBSum):
[pic]
3. Структура опубликована в мае 2001 года.
4. Авторы: van Pouderoyen, G., Eggert, T., Jaeger, K.-E., Dijkstra,
B.W.
5. Метод решения фазовой проблемы: множественное изоморфное замещение;
6. Число измеренных рефлексов:41796;
7. Разрешение:1,5 е.
Минимальное разрешение для указанных рефлексов:40 е.
Максимальное разрешение для указанных рефлексов:1,5 е.
Разрешение является хорошим глобальным индикатором качества модели
пространственной структуры и характеризует эксперимент (объём данных).
В данном случае 1,5 е- достаточно хорошее разрешение.
8. 40441(96,7%) рефлексов имеют силу сигнала больше 3,0;
[pic]
График Вилсона (Wilson plot): логарифм интенсивности рефлекса в зависимости
от его разрешения. Теоретически, должна хорошо приближаться прямой.

Сильно отклоняющиеся рефлексы подозрительны.
9. Две молекулы липазы (A и B) в асимметрической ячейке пространственной
группы P 21 21 21. Они связаны между собой поворотом на 169њ. В
финальную модель для кристаллизации был введен кадмий, который, по-
видимому, связывается с N-концами.
Некристаллографическая симметрия:
WHAT_CHECK: No explicit MTRIX NCS matrices found in the input file
10. R-фактор = 0,177 (obs.)
R-free = 0,206
R-фактор и R-free характеризуют соответствие модели
экспериментальным данным. R-free и (R_free-R) являются значимыми
глобальными индикаторами качества модели пространственной структуры.
Общественно признанные критерии удовлетворены:
R<25%
R_free=20,6%-приемлемое значение для хорошей модели.
R_free-R=0,029<10%-нет доводов в пользу переоптимизации.
11. Полнота данных:82,6%
12. Анализ выдачи программы PROCHECK
Карта Рамачандрана считается одним из лучших глобальных и локальных
индикаторов качества структуры, отражает степени свободы полипептидной цепи
и , как правило, не зависит от процедуры оптимизации модели.
Области на карте Рамачандрана, используемые в сервисе PROCHECK, определены
на основании статистики по PDB (118 структур для данного белка).
В наиболее предпочитаемые области карты попало 268 аминокислот (отличных от
Gly и Pro)(89,6%). В плохих областях вообще нет аминокислотных остатков. В
хорошей модели >90% (не считая глицина и пролина) находятся в
предпочитаемой области. Для Lip A 89,6%. Таким образом, в целом, согласно
этой программе, качество структуры достаточно высокое.

| | |
| | |
| | |
| | |
| | |
| |[pic] |
| |Ramachandran Plot statistics |
| | |
| |No. of |
| |residues %-tage |
| |------ ------ |
| |Most favoured regions [A,B,L] 268 89.6%* |
| |Additional allowed regions [a,b,l,p] 29 9.7% |
| |Generously allowed regions [~a,~b,~l,~p] 2 0.7% |
| |Disallowed regions [XX] 0 0.0% |
| |---- ------ |
| |Non-glycine and non-proline residues 299 100.0% |
| | |
| |End-residues (excl. Gly and Pro) 4 |
| | |
| |Glycine residues 48 |
| |Proline residues 8 |
| |---- |
| |Total number of residues 359 |
| | |
| | |
| |Based on an analysis of 118 structures of resolution of at least 2.0 |
| |Angstroms and R-factor no greater than 20.0 a good quality model would |
| |be expected to have over 90% in the most favoured regions [A,B,L]. |
| | |

13. Другие глобальные факторы:
1) Сравнение двух копий из асимметрической единицы
Анализ WHAT_CHECK

Note: Non crystallographic symmetry RMS plot

The plot shows the RMS differences between two similar chains on a residue-
by-residue basis. Individual "spikes" can be indicative of interesting or
wrong residues. If all residues show a high RMS value, the structure could
be incorrectly refined.

[pic]
Chain identifiers of the two chains: A and B
All-atom RMS fit for the two chains : 1.212

CA-only RMS fit for the two chains : 0.850

Note: Non crystallographic symmetry backbone difference plot

The plot shows the differences in backbone torsion angles between two
similar chains on a residue-by-residue basis. Individual "spikes" can be
indicative of interesting or wrong residues. If all residues show high
differences, the structure could be incorrectly refined.

[pic]
Chain identifiers of the two chains: A and B

Note: No crystallographic symmetry between molecules

No extra crystallographic symmetry was observed between the
independent molecules.

[pic]

Существует разница в интерпретации электронной плотности N-концевых
остатков цепей A и B. Ala 1 плохо идентифицируется в обеих цепях, а Glu2 -в
цепи А. Разница r.m.s. в позициях C? в А и В равна 0,85 е (остатки 3-181).
Основные различия связаны с петлями Ile12-Ser16 и Lys44-Thr45. В молекуле
А эти петли свободно доступны, тогда как в молекуле В участвуют в
кристаллических контактах. В связи с этим, вероятно, молекула А имеет
наиболее характерную конформацию в растворе.
2) Температурный фактор:
FROM WILSON PLOT (A**2) : 13.39
MEAN B VALUE (OVERALL, A**2) : 15.40

[pic]

Остов 1I6W. B-факторы показаны различной толщиной цепи (тонкие =
низкие, толстые = высокие).Цвет, варьирующий от синего к красному
соответствует величине В-фактора (от 10 до 100 ?2). Красные
поверхности показывают регионы, где находятся контакты молекул в
кристаллической ячейке (5? cut-off).

Коэффициент B (atomic displacement parameter)- параметр тепловых колебаний,
параметр атомных смещений. Этот индикатор можно связать со средним
смещением атома в процессе этого движения.
[pic]
(Лекция В.Ю. Лунина)

[pic]
WHAT IF:

Note: B-factor distribution normal

The distribution of B-factors within residues is within expected ranges. A
value over 1.5 here would mean that the B-factors show signs of over-
refinement.

RMS Z-score : 0.543 over 2402 bonds

Average difference in B over a bond : 1.09

RMS difference in B over a bond : 1.57
В среднем, для данной модели, приемлемый параметр атомных смещений. Но В-
фактор относится к «плохим» глобальным индикаторам, так как хорошее его
среднее значение не гарантирует хорошего качества структуры.

3) Пространственный R-фактор (RSR)

Как глобальная характеристика модели:


Map R-value 0.188

RSR характеризует, насколько модель атомов соответствует
«экспериментальной» электронной плотности. Данное значение < 20% =>
неплохое.

4)WHAT_HECK Summary

The second part of the table mostly gives an impression of how well the
model conforms to common refinement restraint values. The first part of the
table shows a number of global quality indicators, which have been
calibrated against structures of similar resolution.
Resolution found in PDB file : 1.50

Structure Z-scores, positive is better than average:
1st generation packing quality : -0.1
2nd generation packing quality : -1.5
Ramachandran plot appearance : -0.9
chi-1/chi-2 rotamer normality : 0.4
Backbone conformation : -0.8

RMS Z-scores, should be close to 1.0:

Bond lengths : 0.277 (tight)
Bond angles : 0.595 (tight)
Omega angle restraints : 0.260 (tight)
Side chain planarity : 0.274 (tight)
Improper dihedral distribution : 0.565
B-factor distribution : 0.543
Inside/Outside distribution : 1.038
==============




II. Выявление маргиналов



1) Потенциальные маргинальные остатки, имеющие большой RSR(EDS)

[pic]


|Цепь А |RSR |Цепь B |RSR |
|180 Thr |0,173 |13 Gly |0,196 |
|181 Asn |0,294 |14 Gly |0,381 |
| | |15 Ala |0,227 |
| | |16 Ser |0,362 |
| | |17 Phe |0,268 |
| | |134 Met |0,204 |











Заметно, что остатки немного неверно вписаны в электронную плотность:

180 Thr цепи А(Z-score RSR=2,093, коэффициент корреляции=0,722, RSR=0,173):
[pic]

14 Gly цепи B (Z-score RSR=6,142, коэффициент корреляции=0,674,
RSR=0,381):
[pic]


17 Phe цепи B (Z-score RSR=5,968, коэффициент корреляции=0,650, RSR=0,268):
[pic]


2) У двух остатков Tyr угол ?2 не попадает в интервал [-90; 90]
(WHAT_CHECK):
The tyrosine residues listed in the table below have their chi-2
not between -90.0 and 90.0
215 TYR ( 37-) B
263 TYR ( 85-) B

37 Tyr цепи B (Z-score RSR=-0,25, коэффициент корреляции=0,974,
RSR=0,069):
[pic]
3) Остатки, имеющие больше 1 торсионного угла в неблагоприятных
областях:
4) 255 SER ( 77-) B -2.5
5) 75 SER ( 77-) A -2.5
6) 108 THR ( 110-) A -2.2
7) 288 THR ( 110-) B -2.1





77 Ser цепи B (Z-score RSR=0,1219, коэффициент корреляции=0,977,
RSR=0,091):
[pic]
4) Инверсия пептидной цепи:
1 HIS ( 3-) A
16 ASN ( 18-) A
58 GLN ( 60-) A
80 ASN ( 82-) A
119 GLN ( 121-) A
136 ASN ( 138-) A
150 HIS ( 152-) A
179 ASN ( 181-) A
181 HIS ( 3-) B
238 GLN ( 60-) B
260 ASN ( 82-) B
316 ASN ( 138-) B
342 GLN ( 164-) B











152 His цепи B (Z-score RSR=0,051, коэффициент корреляции=0,933,
RSR=0,089)

[pic]

5) Неблагоприятное окружение:
6) 132 MET ( 134-) A -5.95
7) 247 LYS ( 69-) B -5.60
8) 222 LYS ( 44-) B -5.50
9) 267 ASN ( 89-) B -5.35
10) 87 ASN ( 89-) A -5.33
11) 42 LYS ( 44-) A -5.30
12) 67 LYS ( 69-) A -5.22
13) 181 HIS ( 3-) B -5.04
14) 228 ASN ( 50-) B -5.04

Окружение Lys 69 цепи В
[pic]
5) Нехарактерные ротамеры
22 SER ( 24-) A 0.36
202 SER ( 24-) B 0.37
54 SER ( 56-) A 0.37

Ser 42 цепи А
[pic]

III. PDB_REDO
| |
| |From PDB |Calculated |After conservative |After full |
| |header |from data |optimisation |optimisation |
|R |0.1810 |0.1741 |0.1741 |0.1803 |
|R-free |0.2060 |0.1809 |0.1809 |0.2097 |
|?R-free | |0.0028 |NA |0.0032 |
|R-free | |8.75 |NA |0.97 |
|Z-score | | | | |



|WHAT_CHECK validation |
| |Original PDB|Conservatively |Fully |
| |entry |optimised |optimised |
|1st generation packing |-0.505 |-0.505 |-0.431 |
|quality1 | | | |
|2nd generation packing |-1.574 |-1.566 |-1.552 |
|quality1 | | | |
|Ramachandran plot |-0.680 |-0.680 |-0.289 |
|appearance1 | | | |
|Chi-1/Chi-2 rotamer |1.515 |1.515 |2.352 |
|normality1 | | | |
|Backbone conformation1 |-0.657 |-0.657 |-0.711 |
|Bond length RMS Z-score2 |0.277 |0.278 |0.680 |
|Bond angle RMS Z-score2 |0.595 |0.595 |0.766 |
|Total number of bumps3 |30 |30 |29 |
|Unsatisfied H-bond |10 |10 |10 |
|donors/acceptors3 | | | |
|Full WHAT_CHECK reports |Link |Link |Link |


1 Higher is better

2 Should be lower than 1.000

3 Fewer is better
Из этих данных видно, что у оптимизированной структуры улучшилось R-value,
RMS Z-score окружения, при этом не улучшилась ситуация ротамерами.

Заключение
V Таким образом, глобальные индикаторы характеризуют достаточно
хорошее качество расшифровки модели. Нет доводов в пользу
переоптимизации модели.
V Карта Рамачандрана не показывает явных outlier' ов .
Гипотетических маргиналов также не так много. Каждый из таких
остатков может быть выделен ,скорее, по одному признаку.
V Протокол WHAT_CHECK представляет собой очень подробный анализ
структуры. Содержит информацию о различных отклонениях, в
частности, о неправильной геометрии и неблагоприятном
окружении.
V Проанализированные маргинальные остатки ,скорее всего,
являются ошибками расшифровки.
V Биологический вывод авторов статьи не основан на
подозрительных в отношении правильности расшифровки данных.


Литература
Статья: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11491291